兩種多酚類物質(zhì)對(duì)Aβ42聚集和毒性的影響及Aβ1-16毒性和炎癥反應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,病情呈進(jìn)行性加重,在幾年內(nèi)喪失獨(dú)立生活能力,10年左右常因并發(fā)感染而死亡。由于老年人群的增長(zhǎng),AD已成為現(xiàn)代社會(huì)的常見病,引起了研究者們的關(guān)注。AD的典型病理特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié),神經(jīng)細(xì)胞外存在神經(jīng)炎斑或稱老年斑,老年斑的中心為β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)。Aβ是含有40-

2、42個(gè)氨基酸的多肽,可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡和突觸丟失,損傷膽堿能神經(jīng)元,影響細(xì)胞Ca2+的平衡,Aβ誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基可破壞細(xì)胞膜,促使脂質(zhì)過(guò)氧化和膜蛋白損傷。生理情況下Aβ是可溶的,低濃度不表現(xiàn)神經(jīng)毒性,當(dāng)可溶性的Aβ達(dá)到了臨界濃度,就會(huì)發(fā)生構(gòu)象的變化,從單體聚集形成具有穩(wěn)定構(gòu)象的寡聚體或纖維。Aβ在AD病人腦中有幾種不同形式,包括可溶性的單體、寡聚體和不可溶的纖維。其中,寡聚體是毒性最大的。
　　 Aβ具有很強(qiáng)的自我聚集能力

3、,尋找一些分子阻止或干擾Aβ聚集或減輕其毒性已成為AD治療的理想靶標(biāo)。研究表明,適當(dāng)?shù)娘嬘眉t葡萄酒可以減輕AD病人的認(rèn)知功能障礙及淀粉樣沉積的病理變化。紅葡萄酒中含有大量的多酚類物質(zhì),這些多酚類物質(zhì)可以與一些肽或蛋白結(jié)合,起到了預(yù)防和治療不同疾病的作用。多酚類物質(zhì)具有潛在的抗淀粉樣蛋白活性,從葡萄籽中提取出來(lái)的多酚類物質(zhì)可以減少Aβ產(chǎn)生,抑制Aβ聚集和毒性,姜黃素也能有效減少腦內(nèi)Aβ毒性和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。本研究以毒性較大的Aβ42為研

4、究對(duì)象,探討了兩種多酚類物質(zhì)白藜蘆醇(Resveratrol,Res)和鞣花酸(Ellagic acid,EA)對(duì)其聚集和細(xì)胞毒性的影響,為尋找預(yù)防和治療AD的理想藥物提供依據(jù)。另外,在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)比較Aβ氨基端多肽的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)高濃度Aβ1-16具有明顯的細(xì)胞毒性,且該毒性作用呈劑量依賴關(guān)系,因此針對(duì)Aβ1-16的毒性及其是否引發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)行了一系列的研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、Res對(duì)Aβ42聚集及細(xì)胞毒性的影

5、響
　　 (1)將不同濃度Res(0、2、10、100 μM)與Aβ42(10μM)37℃共同孵育,分別于0 h、7 h、14 h、21 h、28 h取樣,通過(guò)硫磺素T(Thioflavin T,ThT)熒光方法檢測(cè)Res對(duì)Aβ42聚集的影響；
　　 (2)Aβ42(10μM)與Res(0、10、100 μM)共同孵育,分別于28 h和3 d各取樣10μL,通過(guò)透射電鏡(Transmission Electron Mic

6、roscopy,TEM)觀察Res對(duì)Aβ42聚集過(guò)程的影響；
　　 (3)Aβ42(40μM)與Res(400 μM)共同孵育,以單獨(dú)孵育的Aβ42為對(duì)照,分別于0 h、11 h、15 h、18 h、24 h取樣,通過(guò)圓二色譜儀(Circular Dichroism,CD)檢測(cè)Res對(duì)Aβ42二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響；
　　 (4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa

7、)和斑點(diǎn)印跡法(dot-blot)檢測(cè)加入Res后,不同時(shí)間點(diǎn)Aβ42寡聚體含量的改變；
　　 (5)western-blot觀察Res對(duì)Aβ42聚集的影響和對(duì)Aβ42纖維的解聚作用；
　　 (6)細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)(MTT法)檢測(cè)Res對(duì)Aβ42所致細(xì)胞毒性的影響。
　　 2、EA對(duì)Aβ42聚集及細(xì)胞毒性的影響
　　 (1)Aβ42(10μM)和EA(100μM)共同孵育,分別于2 h、6 h、12 h、

8、24 h取樣10μL,以單獨(dú)孵育的Aβ42為對(duì)照,觀察聚集過(guò)程的變化；
　　 (2)Aβ42與EA共同孵育6 h,通過(guò)western-blot方法檢測(cè)與Aβ42單獨(dú)孵育形成蛋白的差異；
　　 (3)Aβ42(10μM)和EA(100 μM、300μM)共同孵育12 h和24 h,以單獨(dú)孵育的Aβ42為對(duì)照,Elisa方法檢測(cè)EA對(duì)Aβ42聚集形成寡聚體含量的影響；
　　 (4)Aβ42(40 μM)與EA(300

9、 μM)共同孵育,分別于0 h、4 h、6 h取樣,以單獨(dú)孵育的Aβ42為對(duì)照,通過(guò)圓二色譜儀檢測(cè)EA對(duì)Aβ42二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響；
　　 (5)MTT法檢測(cè)不同濃度EA對(duì)Aβ42所致細(xì)胞毒性的影響。
　　 3、Aβ1-16毒性及炎癥反應(yīng)的研究
　　 (1)MTT法比較Aβ42 N端多肽的細(xì)胞毒性；
　　 (2)MTT法測(cè)定不同濃度Aβ1-16的細(xì)胞毒性；
　　 (3)不同孵育溫度、時(shí)間對(duì)Aβ1-

10、16細(xì)胞毒性的影響；
　　 (4)利用Elisa試劑盒檢測(cè)Aβ1-16對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子的影響；
　　 (5)小鼠腦海馬區(qū)定位注射Aβ1-16；
　　 (6)利用Morris水迷宮測(cè)定小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力；
　　 (7)免疫組化檢測(cè)注射Aβ1-16后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化。
　　 結(jié) 果
　　 1、Res對(duì)Aβ42聚集及細(xì)胞毒性的影響
　　 (1)ThT、TEM

11、和CD的結(jié)果表明,Res抑制Aβ42的聚集；
　　 (2)Elisa、Dot-blot、western-blot和TEM結(jié)果表明,Res不抑制Aβ42寡聚體的形成,穩(wěn)定寡聚體的存在；
　　 (3)ThT,western-blot和TEM結(jié)果表明,Res對(duì)Aβ42纖維具有解聚作用；
　　 (4)MTT結(jié)果表明,與2 μM Res共同孵育使Aβ42對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性明顯降低,10μM Res使Aβ42纖維所致

12、的細(xì)胞毒性明顯降低。
　　 2、EA對(duì)Aβ42聚集及細(xì)胞毒性的影響
　　 (1)TEM和western-blot結(jié)果表明,EA加速Aβ42的聚集；
　　 (2)Elisa結(jié)果表明,與EA共同孵育12 h和24 h后,顯著減少了Aβ42寡聚體的含量；
　　 (3)CD結(jié)果表明,加入EA后,在215 nm形成更大的負(fù)峰,說(shuō)明EA加速了β-片層結(jié)構(gòu)的形成；
　　 (4)MTT結(jié)果表明,EA顯著降低了Aβ

13、42引起的細(xì)胞毒性。
　　 3、Aβ1-16毒性及炎癥反應(yīng)的研究
　　 (1)Aβ1-16以30μM作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h后,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則,邊緣不清晰,有聚堆現(xiàn)象；
　　 (2)MTT結(jié)果表明,Aβ1-16對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性呈劑量依賴的形式,隨著濃度的增加,細(xì)胞毒性逐漸增加；
　　 (3)將Aβ1-16分別于4℃,37℃孵育3 d和7 d,結(jié)果表明,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),A

14、β1-16引起的細(xì)胞毒性逐漸下降；
　　 (4)Aβ1-16(30、100 μM)刺激了BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的分泌,不影響IL-1β的分泌；100 μM的Aβ1-16明顯提高了BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-4的水平；
　　 (5)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與對(duì)照組和Aβ1-8組相比,Aβ1-16組的學(xué)習(xí)和空間記憶能力要差。
　　 (6)免疫組化結(jié)果表明,腦海馬區(qū)注射Aβ1-16后,引起了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　

15、　 結(jié) 論
　　 1、Res抑制Aβ42聚集成纖維,但不抑制寡聚體的形成；
　　 2、Res對(duì)Aβ42纖維具有解聚作用；
　　 3、Res可以減輕Aβ42對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性；
　　 4、EA促進(jìn)Aβ42聚集,減少寡聚體存在的時(shí)間,并抑制Aβ42所致的細(xì)胞毒性；
　　 5、Res和EA影響Aβ42聚集的路徑不同,但都減輕了Aβ42的細(xì)胞毒性,一方面可能由于它們的抗氧化作用,另一方面則由于它