慢性乙型肝炎病毒感染病毒復(fù)制與肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)性的初步探討.pdf

1、目的:既往研究結(jié)果提示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）反應(yīng)并與病毒復(fù)制、肝細(xì)胞損傷、肝癌發(fā)生等相關(guān)，但對(duì)HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞ER stress的機(jī)制尚不明確，肝細(xì)胞ER stress反應(yīng)是否與HBV復(fù)制水平有關(guān)尚無研究。本研究通過體內(nèi)、體外研究探討HBV復(fù)制水平與肝細(xì)胞ER stress相關(guān)基因的表達(dá)的相關(guān)性。<

2、br>　　 方法:1、體內(nèi)研究對(duì)象為7例慢性HBV感染者，取肝臟穿刺活檢肝組織液氮冷凍保存，統(tǒng)一提取mRNA，同時(shí)檢測(cè)肝功能并用定量PCR方法測(cè)定外周血HBVDNA;2、體外研究以HBV基因轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株（HepG2.2.15）及人肝癌細(xì)胞株（HepG2）細(xì)胞為研究對(duì)象，分三組:對(duì)照組（HepG2細(xì)胞）、HepG2.2.15細(xì)胞組、拉米夫定（lamivudine，3TC）干預(yù)組（50μg/ml3TC作用于HepG2.2.15細(xì)胞），

3、分別于培養(yǎng)2天、4天、6天收集上清應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitativepolymerase chain reaction，PCR)定量測(cè)定HBV-DNA載量，并同時(shí)收集細(xì)胞提取mRNA;3、以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用SYBR Green熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(SYBRGreen quantitative reverse transcriptase-polymerase chain react

4、ion，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)、X盒結(jié)合蛋白1(X box-bindingprotein1，XBP1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor4，ATF4）及轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的mRNA表達(dá)，以比較

5、不同HBV載量時(shí)ER stress相關(guān)基因表達(dá);4、以HepG2.2.15細(xì)胞組、3TC干預(yù)組為研究對(duì)象，用蛋白免疫印跡方法(western blotting，WB)檢測(cè)GRP78的表達(dá)以判斷ER stress。
　　 結(jié)果:1、慢性HBV感染者肝組織GRP78 mRNA、ATF6 mRNA表達(dá)水平與外周血HBVDNA水平顯著正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); GRP78、CHOP、XBP1及ATF6 mRNA表達(dá)水平

6、與肝組織纖維化程度及炎癥程度無顯著相關(guān)性;HBVDNA≥107copies/ml與HBVDNA＜107copies/ml慢性HBV感染組比較GRP78、CHOP、XBP1及ATF6 mRNA表達(dá)水平相差也無顯著性意義;2、體外細(xì)胞RT-PCR結(jié)果表明拉米夫定處理后HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA水平從2天至6天有所下降，但各組GRP78、CHOP、XBP1及ATF6 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3、體外細(xì)胞WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP7