苦豆子懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其內(nèi)生真菌對(duì)宿主喹諾里西啶生物堿合成積累的影響.pdf

1、近年來(lái)，利用真菌誘導(dǎo)子刺激植物組織提高次生代謝物產(chǎn)量的研究成為熱點(diǎn)，作為一種特定的化學(xué)信號(hào)，真菌誘導(dǎo)子能快速、專(zhuān)一和選擇性地誘導(dǎo)植物多種特定基因的表達(dá)，尤其是活化特定的次生代謝途徑，積累次生代謝產(chǎn)物。內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織中，與植物在長(zhǎng)期“協(xié)同進(jìn)化”過(guò)程中形成了一種穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系。愈來(lái)愈多的研究證明內(nèi)生真菌除了自身產(chǎn)生活性物質(zhì)外，還可作為生物誘導(dǎo)子來(lái)調(diào)節(jié)植物次生代謝物的產(chǎn)生，但內(nèi)生真菌促進(jìn)植物次生代謝物合成積累的機(jī)制報(bào)道較少

2、。本研宄在實(shí)驗(yàn)室多年篩選苦豆子活性?xún)?nèi)生真菌菌株和誘導(dǎo)苦豆子愈傷組織和組培苗的基礎(chǔ)上，建立苦豆子懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，篩選出有效提高苦豆子喹諾里西啶生物堿含量的內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，在此基礎(chǔ)上，初步探討苦豆子內(nèi)生真菌對(duì)宿主細(xì)胞中喹諾里西啶生物堿合成積累的影響。通過(guò)測(cè)定內(nèi)生真菌誘導(dǎo)苦豆子的生理防御反應(yīng)，揭示苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)宿主喹諾里西啶生物堿合成積累的作用機(jī)制。結(jié)果如下:
　　1、以苦豆子子葉和胚軸為材料，對(duì)苦豆子愈傷組織誘導(dǎo)和

3、繼代增殖的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，探索并建立苦豆子懸浮細(xì)胞體系。結(jié)果表明:子葉和胚軸為愈傷組織生成的最佳外植體，愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L;最佳繼代增殖培養(yǎng)基是MS+NAA1.0 mg/L+6-BA4.0 mg/L+2，4-D1.0 mg/L。以胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想材料，初始接種量在10-20％，添加3％的蔗糖，有利于懸浮細(xì)胞體系的生成。

4、>　　2、以苦豆子愈傷組織為試材，采用HPLC法建立氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和苦參堿5種單堿的分離測(cè)定的色譜方法。結(jié)果表明:色譜柱:Ultimate(R)AQ-C18(4.6μm×250 mm×5 mm);流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸緩沖液-甲醇(50:50 V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm;柱溫35℃;流速1.0 mL/min。檢測(cè)愈傷組織中5種單堿含量，其中氧化槐果堿和槐定堿在愈傷組織繼代培養(yǎng)第4代含量相對(duì)較高，分別

5、為1.2056和0.1165mg/g，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，氧化苦參堿、槐果堿、苦參堿含量略有波動(dòng)，大致呈下降趨勢(shì)。
　　3、從苦豆子中分離并鑒定了8株內(nèi)生真菌，分別制備滅活菌絲和菌液濃縮物，研究?jī)?nèi)生真菌誘導(dǎo)子不同種類(lèi)、濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)苦豆子無(wú)菌苗和愈傷組織的生長(zhǎng)以及喹諾里西啶生物堿含量的影響。結(jié)果表明:8株苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子中，菌液濃縮物的誘導(dǎo)效果要強(qiáng)于滅活菌絲。菌株HMGKDF1菌液濃縮物和滅活菌絲能明顯促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)

6、，凈生長(zhǎng)率是對(duì)照的1.82和1.42倍;菌株NDZKDF13菌液濃縮物對(duì)苦豆子愈傷組織生物堿的合成效果明顯，生物堿含量為0.5483 mg/g，是對(duì)照的23.8倍;內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子含糖量在0.01-1.00mg/L時(shí)能夠促進(jìn)無(wú)菌苗中喹諾里西啶生物堿合成積累。
　　4、以4株高活性苦豆子內(nèi)生真菌菌液濃縮物為誘導(dǎo)子，研究其對(duì)苦豆子無(wú)菌苗生理防御反應(yīng)和喹諾里西啶生物堿積累的影響。結(jié)果表明-4株苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子均可促進(jìn)喹諾里西啶生物堿的