基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘.pdf

1、目的:
　　通過對(duì)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)深入研究，挖掘揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因，并對(duì)其基因表達(dá)特性及功能進(jìn)行研究，為深入認(rèn)識(shí)陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為推進(jìn)陽(yáng)春砂萜類活性成分的代謝工程調(diào)控及種質(zhì)資源優(yōu)化提供幫助。
　　方法:
　　通過對(duì)陽(yáng)春砂果實(shí)不同成熟時(shí)期及MeJA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中KEGGpathway注釋情況進(jìn)行篩選并統(tǒng)計(jì)，并結(jié)合陽(yáng)春砂中含有的主要揮發(fā)性萜類成分及其在單萜、倍半萜類化合

2、物生物合成途徑中的相關(guān)酶基因，在NCBI中查找并下載龍腦基二磷酸合酶、蒎烯合酶、松油烯合酶等4個(gè)單萜合酶與雙環(huán)大根香葉烯合酶等5個(gè)倍半萜合酶的其他物種中相應(yīng)基因的蛋白序列，通過本地BLAST軟件對(duì)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行blastp、tblastn比對(duì)再注釋，獲取更多候選unigene，再通過同源進(jìn)化分析、轉(zhuǎn)錄組間關(guān)聯(lián)比對(duì)等方法最終篩選出陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因(AvTPS)。
　　對(duì)候選AvTPS基因進(jìn)行開放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)

3、，并對(duì)含有全長(zhǎng)ORF的AvTPS基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼區(qū)全長(zhǎng)DNA，通過平末端連接的方法構(gòu)建目的AvTPS基因的克隆載體;并通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)這些基因的開放閱讀框、編碼氨基酸、編碼蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親疏水性等理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位及一二級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過與已知TPS的多序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析推測(cè)其功能。
　　通過絕對(duì)定量法對(duì)克隆所得AvTPS基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析其在陽(yáng)春砂不同部位及不同成熟時(shí)期的表達(dá)水平變

4、化;并通過MeJA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中AvTPS基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及揮發(fā)性萜類含量數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩線性相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，分析AvTPS基因與陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類成分的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　3.1 陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘
　　本文從2個(gè)陽(yáng)春砂轉(zhuǎn)錄組中共篩選獲得揮發(fā)性萜類合成下游途徑相關(guān)unigene27個(gè)，包括轉(zhuǎn)錄組直接注釋unigene9個(gè)，本地blast再注釋unigene18個(gè);并結(jié)合與NCBIblastp所得相似序列的同源進(jìn)

5、化分析、轉(zhuǎn)錄組間unigene的序列相似性分析，最終選定11個(gè)陽(yáng)春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因，重命名為AvTPS1～11。
　　3.2 AvTPS編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆及其編碼蛋白功能分析
　　對(duì)有全長(zhǎng)ORF的4個(gè)AvTPS編碼區(qū)全長(zhǎng)進(jìn)行了克隆，AvTPS1包含1803bp的ORF，編碼600個(gè)氨基酸;AvTPS3包含1791bp的ORF，編碼597個(gè)氨基酸;AvTPS5包含888bp的ORF，編碼295個(gè)氨基酸;AvTPS8包

6、含1650bp的ORF，編碼549個(gè)氨基酸;并成功構(gòu)建其重組克隆載體pLB-AvTPS1、pLB-AvTPS3、pLB-AvTPS5和pLB-AvTPS8。除AvTPS5外，其他3個(gè)AvTPS預(yù)測(cè)蛋白分子量均在60～70kDa之間、等電點(diǎn)接近5.0、pH接近中性，與其他已知TPS相似;結(jié)構(gòu)上也具有DDXXD等TPS特征功能域，與其他已知TPS也表現(xiàn)出較近的遺傳距離，將AvTPS1和AvTPS3歸類于單萜合酶，AvTPS8歸類于倍半萜合酶

7、。AvTPS5編碼蛋白各性質(zhì)則更接近于萜類環(huán)化下一階段的脫氫還原酶。
　　3.3 AvTPS基因的表達(dá)變化及相關(guān)性分析
　　本研究對(duì)克隆所得4個(gè)AvTPS基因進(jìn)行了qRT-qPCR表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果表明AvTPS1、AvTPS3和AvTPS8表現(xiàn)出顯著的組織特異性，AvTPS1、AvTPS3和AvTPS5則表現(xiàn)出了生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)特異性，符合萜類合酶表達(dá)與調(diào)控的時(shí)空差異的特點(diǎn)。進(jìn)一步將各AvTPS的表達(dá)量數(shù)據(jù)與陽(yáng)春砂揮發(fā)性

8、萜類數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，證明大部分AvTPS均與陽(yáng)春砂中的揮發(fā)性萜類化合物含量總量呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，AvTPS2、AvTPS5、AvTPS7和AvTPS9表現(xiàn)出較一致的相關(guān)模式， AvTPS6和AvTPS11則往往表現(xiàn)出另一類相反的相關(guān)模式;且根據(jù)與具體萜類化合物含量的關(guān)聯(lián)分析，在果皮中表達(dá)較高的AvTPS1、AvTPS2等及在種子團(tuán)中表達(dá)較高的AvTPS3、AvTPS6等分別與不同部位的主要成分分別呈正相關(guān)，可能在這些物質(zhì)的合成途徑中起到