兩株海綿來源真菌抗腫瘤活性成分研究及宏基因新技術(shù)在海綿共附生菌中應(yīng)用初探.pdf

1、海綿共附生微生物因其次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特，目前已成為抗腫瘤藥物研究的重要資源。本文對(duì)兩株海綿來源的抗腫瘤活性真菌黃灰青霉Penicillium auratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－15的抗腫瘤活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了較系統(tǒng)地研究。此外，本文還對(duì)利用宏基因技術(shù)從未培養(yǎng)海綿共附生微生物中尋找生物活性代謝產(chǎn)物的方法進(jìn)行了初步探索。 對(duì)黃灰青霉P．a(chǎn)uratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－1

2、5分別進(jìn)行大量發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取得粗提物；采用人慢性髓性白血病K562細(xì)胞，以細(xì)胞增殖抑制活性結(jié)果為分離向?qū)?，采用減壓硅膠柱層析、凝膠柱層析(SephadexLH－20)、反相硅膠柱層析(RP-18)和反相制備高效液相(HPLC)等分離手段，從兩株真菌的乙酸乙酯提取物中分離得到27個(gè)化合物；利用理化性質(zhì)和光譜學(xué)方法(uv、IR、MS、1D-NMR和2D-NMR)鑒定了其中23個(gè)化合物。其中分離自黃灰青霉P.auratiogris

3、eum的18個(gè)化合物分別為：Auratiomide A(1)，Auratiomide C(2)，Anacine(3)，F(xiàn)ructigeninesA(4)，F(xiàn)ructigenines B(5)，PseurotinA(6)，青霉菌素(7)，青霉菌醇(8)，Viridicatol(9)，3-甲氧基4-苯基喹啉酮(10)，3-甲基喹唑啉酮(11)，(2s，4S)-2,4,8一trihydroxy-3，4-dihydronaphthalen-1(

4、2H)-one(12)，( 2S，4R)-2,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2h)-one(13)，(3R，4R)-3,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(14)，麥角甾醇(15)，N-(2-羥苯基)乙酰胺(16)，N-(2-(甲氨基)苯基)乙酰胺(17)和大黃素(18)；分離自菌株CTFS-15的5個(gè)化合物分別為：過氧化麥角甾醇(

5、19)，對(duì)羥基苯乙酰胺(20)，7-羥基-4-甲氧基-5-甲基香豆素(21)，環(huán)-(丙-亮)(22)，靛紅(23)。 利用人(K562、A549、BEL．7402、HL-60)及小鼠(tsFT210、P388)腫瘤細(xì)胞，以細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期抑制活性為指標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、SRB等方法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性的初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll、12、13、14、16、23對(duì)

6、K562細(xì)胞具有不同程度的細(xì)胞增殖抑制活性，化合物15、19對(duì)tsFT210細(xì)胞具有強(qiáng)烈的壞死性細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步研究表明，化合物8、20對(duì)K562細(xì)胞具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，化合物3、18對(duì)K562細(xì)胞具有細(xì)胞周期的G<,0>／G<,1>期抑制活性，化合物23對(duì)P388細(xì)胞具有細(xì)胞周期的G<,2>／M期抑制活性。其中，化合物7、8、11、12、13、14、16、20、23對(duì)K562細(xì)胞的活性為首次報(bào)道；化合物23對(duì)P388細(xì)胞的G<,2

7、>／M期抑制活性為首次報(bào)道。對(duì)于黃灰青霉Pauratiogriseum，生物堿類化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll和四氫萘酮類化合物12、13、14是其抗腫瘤活性的主要結(jié)構(gòu)類型。對(duì)于菌株CTFS-1 5，化合物19、20、23是其主要抗腫瘤活性成分。 在利用宏基因技術(shù)開拓未培養(yǎng)海綿共附生微生物藥用資源的研究中，直接提取海綿共附生微生物基因組DNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因工程菌，從中隨機(jī)篩選到2株能夠抑制四聯(lián)球菌生長(zhǎng)的工程菌，利用高壓

8、液相色譜對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，工程菌的高壓液相指紋圖譜與宿主菌的存在明顯差別，這說明工程菌中產(chǎn)生了不同于宿主菌的代謝產(chǎn)物。以上結(jié)果證明了通過宏基因技術(shù)構(gòu)建工程菌來尋找未培養(yǎng)海綿共附生微生物活性代謝產(chǎn)物這一新途徑從方法學(xué)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上來說都是可行的。 綜上，本文通過對(duì)兩株海綿來源真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，初步闡明了黃灰青霉P. auratiogriseum(Sp-19)和菌株CTFS-15抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，確定了活