丹參WRKY轉(zhuǎn)錄組分析及其在次生代謝物生物合成途徑上的調(diào)控研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)不僅是一種重要的大宗藥用植物，還是一種研究藥用植物的模式生物。因此，研究丹參次生代謝積累及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制具有深遠(yuǎn)的意義及廣闊的應(yīng)用前景。WRKY是植物十大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、生物或非生物脅迫響應(yīng)等多種生理過程，最近研究發(fā)現(xiàn)該家族成員參與多種次生代謝物合成的調(diào)控，然而，有關(guān)丹參WRKY轉(zhuǎn)錄因子(SmWRKY)是否調(diào)控次生代謝物的合成卻知之甚少。為此，本文采用生

2、物信息學(xué)、分子生物學(xué)、植物化學(xué)等方法對(duì)SmWRKY家族成員的種類、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)譜、以及其與次生代謝物積累的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。本研究既加深了人們對(duì)SmWRKY的認(rèn)識(shí)，又為進(jìn)一步探索SmWRKY的功能及其調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　1.從丹參轉(zhuǎn)錄組庫中共發(fā)現(xiàn)69條完整的SmWRKY的CDS序列，編碼的氨基酸長(zhǎng)度范圍：129-706個(gè)，等電點(diǎn)(Pi)從4.76-9.9；分子質(zhì)量(Mw)從15.2-36.2 kDa。SmW

3、RKY的核心結(jié)構(gòu)域不僅有常見的WRKYGQK，還有WRKYGEK、WRKYGKK。根據(jù)WRKY核心結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，將WRKY分為3類(I類、II類、III類)，第II類又分為5個(gè)亞類(IIa類、IIb類、IIc類、IId類、IIe類)。其中在丹參中發(fā)現(xiàn)13個(gè)I類WRKY成員，46個(gè)II類WRKY成員，9個(gè)III類WRKY成員。為了進(jìn)一步研究 SmWRKY結(jié)構(gòu)特征，采用在線軟件MEME5.0對(duì)SmWRKY氨基酸序列進(jìn)行保守基

4、序預(yù)測(cè)，結(jié)果表明所有的序列均含保守基序(Motif)Motif1和Motif2，說明此結(jié)構(gòu)是SmWRKY的保守結(jié)構(gòu)域。除此之外，不同類群的WRKY擁有特定的保守序列。這些結(jié)果說明SmWRKY家族基因趨異進(jìn)化，含有較多的功能元件，也暗示該家族基因可能參與多種生理生化調(diào)控過程。
　　2.丹參毛狀根培養(yǎng)18d時(shí)，添加茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol·L-1)，在MeJA處理后第0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2

5、d、3d、6d、9d采集樣品，采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)毛狀根中丹酚酸類和丹參酮類部分成分含量進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)SmWRKY、丹參酮類和丹酚酸類生物合成途徑上關(guān)鍵酶基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)基因表達(dá)構(gòu)建heatmap圖結(jié)果顯示：大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)MeJA的誘導(dǎo)，表達(dá)模式大體分為3類：大部分上調(diào)表達(dá)，少部分下調(diào)表達(dá)，一部分在不同時(shí)間點(diǎn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。同時(shí)也測(cè)定了在MeJA誘導(dǎo)下4種丹參酮類物

6、質(zhì)(二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮)和3種酚酸類物質(zhì)(迷迭香酸、丹酚酸B、咖啡酸)的含量，結(jié)果表明在MeJA的誘導(dǎo)下積累量也發(fā)生了顯著的變化。除了丹參酮I外，其它6種次生代謝成分隨時(shí)間的增加，積累量不斷增加，從第6d開始，處理組的積累量顯著高于對(duì)照組。而丹參酮 I的積累模式處理后第9d，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組。為了進(jìn)一步研究SmWRKY與次生代謝物積累之間的關(guān)系，我們采用SPSS軟件，雙變量相關(guān)性分析―基因-次生代謝物之間的關(guān)

7、系，推測(cè)SmWRKY36、SmWRKY45等7個(gè)WRKY可能參與酚酸類的生物合成；SmWRKY3、SmWRKY12等9個(gè)WRKY可能參與丹參酮類生物合成；SmWRKY1、SmWRKY7等7個(gè)WRKY可能參與這兩類化合物的生物合成。
　　3.采用qRT-PCR測(cè)定不同花期SmWRKY和次生代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，構(gòu)建heatmap圖。結(jié)果顯示：這74個(gè)基因表達(dá)譜可分為三類，第一類含有7個(gè)基因，在莖和葉組織中表達(dá)量較高，推測(cè)可能參與光合

8、作用等生理活動(dòng)；第二類包含的基因較多，表達(dá)模式多樣化；這可能與WRKY功能多樣化相關(guān)。第三類包含兩個(gè)基因，SmWRKY47和SmWRKY60，在一些組織中不表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)同一類群的WRKY表達(dá)模式較為相似，如I、IIb、IIc、IIe和III類WRKY分別有61.％、37.5%、44.5%和66.6%、55.5%的成員在基因表達(dá)譜上聚在一起，這可能由于同一類的WRKY序列相似，導(dǎo)致表達(dá)模式相似。另外丹參酮合成途徑上有50%的關(guān)鍵酶基因，

9、丹酚酸合成途徑上有42.8%的基因表達(dá)模式也相似。這可能與這些基因所行使的功能相似所造成。
　　4.從丹參轉(zhuǎn)錄組庫中獲得完整的SmWRKY65序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物克隆該基因，經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)長(zhǎng)度為867bp，共編碼288個(gè)氨基酸，含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY基因家族第IIa類成員，與預(yù)期結(jié)果一致。為了進(jìn)一步研究其功能，我們克隆了SmWRKY65的編碼區(qū)，構(gòu)建了SmWRKY65的過表達(dá)載體，采用