地衣芽孢桿菌CGMCC2876生物絮凝劑的合成代謝途徑及其基因調控研究.pdf

1、石油危機和高分子材料難降解等問題突顯，環(huán)境友好型高分子材料的開發(fā)與應用引起了極大的關注。生物絮凝劑因其無毒、能自然降解等特性在水處理領域倍受青睞。目前已經篩選并鑒定的生物絮凝劑產生菌株眾多，但其代謝途徑和相關分子水平的研究還鮮有報道。
　　 本研究從多糖絮凝劑產生菌地衣芽孢桿菌CGMCC2876出發(fā)，改變其培養(yǎng)條件，合成出形態(tài)和性質都異于多糖的生物絮凝劑，通過紫外光譜、紅外光譜、質譜、高效液相色譜以及核磁分析，鑒定出該生物絮凝劑

2、由94.43％γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、3.92％多糖和1.65％蛋白質組成。
　　 首先，對實驗菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定其最佳培養(yǎng)基組成(gL-1):檸檬酸三鈉20，甘油20，NH4Cl9，谷氨酸鈉10，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO40.5，pH7.2;最佳培養(yǎng)條件:200 rpm，37℃搖瓶培養(yǎng)20 h。此時，絮凝活性達到11670U mL-1，產量為21.8 gL-1。同時，該生物絮凝劑具有良好的pH和熱穩(wěn)定

3、性，與常用的化學絮凝劑聚丙烯酰胺相比，在制糖工業(yè)澄清工段中脫色效果相當，除濁能力更強。
　　 其次，考察培養(yǎng)基成分對實驗菌株合成的γ-PGA分子結構的影響，結果表明:實驗菌株為兼性谷氨酸依賴型，當不添加谷氨酸鈉時，γ-PGA由62.22％D-谷氨酸(D-Glu)單體組成，反之，由37.09％D-Glu組成;γ-PGA的分子量主要有三種:2.0×106 Da、6.0×105 Da和2.0×105 Da，三者含量與檸檬酸三鈉的濃度有

4、關。同時，γ-PGA的產量、D-Glu的含量及2.0×105 Da含量與其絮凝活性呈正相關性，6.0×105 Da和L-Glu的含量則呈反相關性。
　　 隨后，克隆了實驗菌株中γ-PGA合成酶基因—pgsBCA，該基因由3個開放閱讀框架組成，大小為2974bp，與B.licheniformis WBL-3中pgsBCA基因的相似度為98％。在E.coli JM109細胞外不僅可以合成γ-PGA而且有較高的絮凝活性。利用數據庫對γ

5、-PGA合成酶復合物(PgsBCA)進行定位并分析其3-D結構、生化性質和功能，探索其相互作用機制:PgsB參與γ-PGA的延伸，PgsA可被Mg2+激活將γ-PGA從結合位點脫離，與PgsC將產物運輸到胞外。
　　 同時，對課題組篩選獲得的陽性多糖絮凝劑克隆子的插入片段進行注釋，大小為29.6 kb，由26個開放閱讀框架組成，分析其所編蛋白質的生化性質、功能及參與的代謝途徑。確定了實驗菌株合成多糖絮凝劑的關鍵基因:糖基磷酸轉移

6、酶基因（bli2）、糖基轉移酶基因(bli16)、ABC轉運蛋白基因(bli9、bli10和bli11和多糖絮凝劑降解的基因(bli1)，以及兩個基因簇(bli7～11和bli16～18)，并構建了實驗菌株合成多糖絮凝劑的代謝途徑。
　　 最后，采用基因敲除的方法，考察了pgsBCA基因對實驗菌株合成生物絮凝劑的影響。利用重疊PCR技術成功構建pgsBCA基因敲除質粒并導入實驗菌株中，但pgsBCA基因缺失菌株的篩選還在進行。為