鼠腦缺血再灌后神經(jīng)元凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制及依達(dá)拉奉的影響.pdf

1、背景與目的:腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡受許多基因調(diào)控。在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的三種途徑中，線粒體和死亡受體途徑已受到廣泛關(guān)注，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑研究相對少見，且多集中在體外細(xì)胞研究方面。腦缺血再灌注后存在鈣穩(wěn)態(tài)失衡和過氧化損傷，由此可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯水平下降和誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)反應(yīng)中，PERK介導(dǎo)的UPR信號通路頗為重要，因?yàn)樵摶虻幕罨鸬膃IF2 α磷酸化可直接誘發(fā)蛋白質(zhì)合成抑制，并可誘導(dǎo)ATF4、CHOP與GA

2、DD34等UPR靶基因在缺血后表達(dá)。體外研究揭示PERK通路活化所致的蛋白質(zhì)合成抑制在短時(shí)間內(nèi)與細(xì)胞的自我保護(hù)、促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)，長時(shí)間的蛋白質(zhì)合成抑制則可通過一些致凋亡基因如CHOP、caspase-12的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前在腦缺血模型中有關(guān)PERK介導(dǎo)的UPR信號通路的研究極為少見，且所用模型不一，尚缺乏在大鼠短暫性MCAO模型中對PERK、ATF4、CHOP、GADD34等基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)研究。 本研究第一部分通

3、過檢測局灶性腦缺血后PERK、ATF4、CHOP和GADD34等UPR基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)變化，以探討它們在腦缺血損傷中的作用及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，從而為完善腦缺血后細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；第二部分則應(yīng)用自由基清除劑依達(dá)拉奉對大鼠短暫性MCAO模型進(jìn)行干預(yù)，研究依達(dá)拉奉對ERS后PERK通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)合細(xì)胞凋亡檢測及腦梗死體積測定，以期闡明依達(dá)拉奉新的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，從而為臨床治療腦缺血提供理論基礎(chǔ)和新的治療思路。

4、 方法: 實(shí)驗(yàn)第一部分將10-12周齡健康雄性SD大鼠156只隨機(jī)分為正常組(n=12)、假手術(shù)組(n=72)和腦缺血模型組(n=72)； 實(shí)驗(yàn)第二部分使用健康雄性SD大鼠144只，腦缺血模型制作成功后隨機(jī)分為對照組(n=72)和依達(dá)拉奉干預(yù)組(n=72)。均采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，缺血2小時(shí)后恢復(fù)再灌注，Longa’s的5級標(biāo)準(zhǔn)評分法評價(jià)神經(jīng)功能缺損。再灌注后1h、3h、6h、12h、24

5、h及72h處死動(dòng)物。HE染色和Nissl染色觀察病理學(xué)變化，TTC染色測定腦梗死體積，免疫組織化學(xué)及RT-PCR法分別檢測缺血側(cè)頂葉大腦皮層p-PERK、ATF4、CHOP、GADD34等蛋白和mRNA表達(dá)變化；末端標(biāo)記法原位檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論: 1．腦缺血再灌注誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動(dòng)了PERK介導(dǎo)的UPR信號通路。 2．大鼠腦缺血再灌注后，CHOP mRNA在12小時(shí)內(nèi)表達(dá)增加，蛋白水平在24小時(shí)內(nèi)表達(dá)增