益智仁中原兒茶酸對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)作用研究.pdf

1、本研究選用與多巴胺能神經(jīng)元有許多相似特征的PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以過氧化氫(H2O2)、谷氨酸(Glu)、及1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)等神經(jīng)毒素分別誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，從而建立體外多巴胺能細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型。結(jié)果表明，以上三種毒素均可對(duì)多巴胺能的PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，在一定濃度范圍內(nèi)其毒性作用呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，選擇H2O20.4mM(24h)、Glu10mM(48h)、及Mpp+1mM(48h)作為下一步實(shí)驗(yàn)

2、的模型條件。 通過以上建立的損傷模型，對(duì)益智仁中的神經(jīng)活性部位進(jìn)行跟蹤篩選。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益智仁的乙酸乙酯部位具有明顯的抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)的保護(hù)作用；對(duì)其進(jìn)一步分離純化，最終得到一個(gè)活性單體化合物。采用光譜學(xué)技術(shù)(紅外、紫外、核磁共振波譜和質(zhì)譜)對(duì)得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，最后鑒定為一種酚類化合——3，4-羥基苯甲酸，即原兒茶酸(Protocatechuicacid，PCA)。PCA從益智仁中分離得到目前尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。在0.06

3、～1.2mM的劑量范圍內(nèi)，PCA對(duì)細(xì)胞具有一定的增殖作用，而且劑量依賴地保護(hù)了氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞死亡。通過比較在不同損傷模型中的半數(shù)有效劑量(IC50)發(fā)現(xiàn)，PCA對(duì)Mpp+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有更加明顯的保護(hù)作用，這個(gè)結(jié)果提示了PCA在不同毒素中的不同作用機(jī)制。 利用H2O2造成PC12細(xì)胞的直接氧化應(yīng)激損傷，探討PCA在神經(jīng)細(xì)胞中的抗氧化機(jī)制。培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定與MTT的結(jié)果基本一致，PCA劑量依賴地減少了細(xì)胞中

4、LDH的漏出；通過細(xì)胞核的形態(tài)觀察以及流式細(xì)胞儀的分析，PCA可以減少H2O2介導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡性死亡；PCA抗H2O2氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與細(xì)胞內(nèi)GSH水平的提高及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的激活相關(guān)，雖然谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性并沒有顯著變化；另外，H2O2和Fe2+可以通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH)，而PCA同樣顯著減弱了H2O2/Fe2+所致的細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明了在受活性

5、氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷時(shí)，PCA可以有效的保持PC12細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系處于正常的水平，從而抑制細(xì)胞的功能衰竭而死亡。 利用Mpp+介導(dǎo)的PC12細(xì)胞間接氧化應(yīng)激損傷，探討PCA在神經(jīng)細(xì)胞中的抗凋亡機(jī)制。LDH分析證明了PCA能夠保護(hù)質(zhì)膜的完整性而抑制Mpp+介導(dǎo)的LDH漏出；同樣形態(tài)觀察及流式細(xì)胞儀的分析，證實(shí)PCA可顯著抑制Mpp+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而且，實(shí)驗(yàn)還采用AnnexinV-PI雙染的方法分析檢測(cè)了細(xì)胞凋亡

6、和壞死的比率，PCA能夠劑量依賴地降低凋亡/壞死細(xì)胞的比例；PCA抑制Mpp+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可通過阻止膜電位(MMP)的喪失，抑制ROS的產(chǎn)生，減少GSH的耗竭，促進(jìn)SOD和CAT的激活及拮抗caspase-3的活性和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明了PCA可能是通過調(diào)節(jié)線粒體的通透性而抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡。 總之，本研究的結(jié)果表明，PCA是益智仁中的主要活性成分之一，有可能在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病(如PD)的