實時定量PCR分析腸道正常菌群及其在實驗性肝損傷研究中的初步應(yīng)用.pdf

1、當(dāng)前研究顯示肝臟和腸道微生態(tài)不僅在解剖結(jié)構(gòu)上，而且在功能上都存在著密切的關(guān)系。腸道內(nèi)寄居著種類繁多，數(shù)量巨大的細(xì)菌，是機體內(nèi)最大的儲菌庫和內(nèi)毒素池，是內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥的主要來源。在正常情況下，腸道正常菌群與黏膜表面的粘蛋白、sIgA、完整的腸黏膜結(jié)構(gòu)及腸壁免疫細(xì)胞共同構(gòu)成了腸道的黏膜屏障系統(tǒng)，阻止了腸道細(xì)菌，內(nèi)毒素向腸外移位。在某些病理情況下如重型肝炎，肝硬化，嚴(yán)重?zé)齻?，小腸移植等均可以出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡，腸壁屏障功能損傷，細(xì)菌移

2、位以及腸源性內(nèi)毒素血癥。 近來實驗研究和臨床資料多集中于肝衰竭、肝硬化對腸道微生態(tài)的影響，但主要基于直腸糞便樣本的分析，結(jié)果顯示雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌下降而腸桿菌等有害菌升高的趨勢。有關(guān)肝損傷的腸道微生態(tài)變化研究資料不多，各腸段正常菌群數(shù)量和分布規(guī)律未見報道。臨床上對腸道正常菌群的定量分析主要采用傳統(tǒng)分析方法，但費時、易受操作影響，近幾年來有研究采用基于16SrRNA基因有關(guān)的實時定量PCR(Real-TimePCR)技術(shù)定量

3、分析腸道菌群演替規(guī)律，資料不多且缺乏比較。為進(jìn)一步弄清肝損傷時腸道微生態(tài)變化及大腸各節(jié)段正常菌群分布規(guī)律，我們采用種屬特異性探針結(jié)合Real-TimePCR技術(shù)，定量分析正常和肝損傷動物模型的不同大腸節(jié)段微生態(tài)狀況，設(shè)計進(jìn)行了如下實驗。 第一部分：Real-TimePCR檢測不同腸段腸道正常菌群及與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的比較 材料與方法： 1.研究對象SD大鼠6只，雌雄各半，體重150±10g。 2.研究標(biāo)本新鮮

4、糞便 3.研究方法 3.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法定量分析腸道正常菌群。 3.2含有腸道目標(biāo)細(xì)菌特異性16SrRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建、克隆建庫及測序。 3.3熒光定量PCR定性、定量分析大腸不同節(jié)段內(nèi)容物目的細(xì)菌群。 3.4SPSSf0rWindows用于統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析正常大鼠不同節(jié)段腸道正常菌群顯示，各分析菌群在空腸、回腸迅速升高，盲腸達(dá)到峰值，結(jié)腸和直腸各菌群

5、數(shù)量較盲腸變化不明顯(p＞0.05)。小腸內(nèi)容物總DNA采用試劑盒未能提取。Real-TimePCR分析顯示，各分析目的菌群在盲腸、結(jié)腸和直腸檢測結(jié)果變化不明顯。兩種檢測方法檢測結(jié)果相比較，各菌群數(shù)值在大腸各節(jié)段變化規(guī)律是一致的。 第二部分：Real-TimePCR定量分析急性肝損傷模型腸道微生態(tài)狀況及相關(guān)干預(yù)的影響 實驗分組：將SD大鼠分成五組(每組10只動物) (1)正常對照組：正常大鼠，2ml滅菌水。

6、 (2)對照組：急性肝損傷大鼠模型，2ml滅菌水。 (3)甘利欣組：急性肝損傷大鼠模型，甘利欣15mg/kg·d灌胃。 (4)肝生元組：急性肝損傷大鼠模型，GSY-145mg/kg·d灌胃。 (5)螺旋藻組：急性肝損傷大鼠模型，螺旋藻500mg/kg·d灌胃。 各組于造模前5日開始灌胃，造模后48h處死動物采集標(biāo)本，每組隨機挑選3只雌鼠和3R雄鼠，共6只動物用于分析盲腸、結(jié)腸和直腸3個腸段正常菌群構(gòu)成，

7、并與傳統(tǒng)方法結(jié)果比較。所有動物均檢測血漿內(nèi)毒素水平，腫瘤壞死因子水平，肝功能以及肝臟的病理改變。 結(jié)果： 1.急性肝損傷對照組大鼠出現(xiàn)明顯的腸道菌群紊亂，Real-TimePCR與傳統(tǒng)方法定量分析盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物菌群狀況，3個節(jié)段表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌的增加(與正常對照組比較P＜0.01)，雙歧桿菌下降(與正常對照組比較P＜0.01)。血清ALT，AST，血漿內(nèi)毒素水平和腫瘤壞死因子α水平升高(與正常對照組比較

8、P＜0.01)。 2.造模前給予甘利欣，肝生元和螺旋藻均可降低造模后2日的內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子水平(與對照組比較，P＜0.01)。肝生元和螺旋藻組雙歧桿菌數(shù)量增加(與對照組比較，P＜0.01)，腸球菌和桿菌降低(與對照組比較，P＜0.01)。與對照組比較，甘利欣組調(diào)節(jié)菌群效果不明顯(P＞0.01)。在干預(yù)因素存在下，定量分析急性肝損傷動物模型不同腸段菌群，Real-limePCR檢測所獲結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)方法獲得的結(jié)果存在一致性。

9、 第三部分：Real-TimePCR定量分析慢性肝損傷模型腸道微生態(tài)狀況及相關(guān)干預(yù)的影響 實驗分組：將SD大鼠分成五組(每組10只動物) (1)正常對照組：正常大鼠，2ml滅菌水。 (2)對照組：慢性肝損傷大鼠模型，2ml滅菌水。 (3)甘利欣組：慢性肝損傷大鼠模型，甘利欣15mg/kg·d灌胃。 (4)肝生元組：慢性肝損傷大鼠模型，GSY-145mg/kg·d灌胃。 (5)螺旋藻組

10、：慢性肝損傷大鼠模型，螺旋藻500mg/kg·d灌胃。 各組于造模前3月前開始灌胃，皮下注射CC14每周1次造模，劑量為0.2ml/kg；每次注射前CC14用花生油稀釋，濃度逐漸遞增，即每2周遞增5％，依次為5％、10％、15％、20％、25％、30％；連續(xù)3個月，共注射12次。末次造模后48h處死動物采集標(biāo)本，每組隨機挑選3只雌鼠和3R雄鼠，共6只動物用于分析盲腸、結(jié)腸和直腸3個腸段正常菌群構(gòu)成。所有動物均檢測血漿內(nèi)毒素水平，

11、腫瘤壞死因子水平，肝臟纖維化，肝功能以及肝臟的病理改變。 結(jié)果： 1.實驗性慢性肝損傷對照組大鼠出現(xiàn)明顯的腸道菌群紊亂，Real-TimePCR與傳統(tǒng)方法定量分析盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物菌群狀況，3個節(jié)段均表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌的增加(與正常對照組比較P＜0.01)，雙歧桿菌下降(與正常對照組比較P＜0.01)。血清ALT，AST，血漿內(nèi)毒素水平和腫瘤壞死因子α水平升高(與正常對照組比較P＜0.01)，PLD、TGF-

12、β1和HA三個肝纖維化指標(biāo)亦非常顯著增高(P＜0.01) 2.造模前給予甘利欣，肝生元和螺旋藻均可降低造模后2日的內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子水平(與對照組比較，P＜0.01)。肝生元和螺旋藻組雙歧桿菌數(shù)量增加(與對照組比較，P＜0.01)，腸球菌和桿菌降低(與對照組比較，P＜0.01)。與對照組比較，甘利欣組調(diào)節(jié)菌群效果不明顯(P＞0.01)。在干預(yù)因素存在下，定量分析慢性肝損傷動物微生態(tài)，Real-TimePCR檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)

13、果存在一致性。 結(jié)論： 應(yīng)用Real-TimePCR技術(shù)分析證實，急性和慢性肝損傷后均存在較明顯的腸道微生態(tài)的紊亂；而肝生元和螺旋藻能在一定程度上改善實驗性肝損傷后腸道菌群失衡，增加腸道的定植抗力，降低血內(nèi)毒素水平，起到一定護肝作用。 本研究結(jié)果提示，Real-TimePCR技術(shù)分析不同腸大腸節(jié)段正常菌群所獲得的結(jié)果，在正常動物，實驗性肝損傷動物模型以及干預(yù)因素存在條件下，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有很好的一致性，且具有便捷