原癌基因Lmo2不同剪接方式的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士(學(xué)位)論文原癌基因Lmo2不同剪接方式的叁竺.透拉的構(gòu)建及表達(dá)專業(yè):臨床醫(yī)學(xué)(七年制)研究生:劉隸寧導(dǎo)師:朱天慧中文摘要冬mo:是隸屬于LIM蛋白家族的一個T淋巴細(xì)胞白血病原癌基因，研究顯示它與胚胎卵黃囊期紅系發(fā)育、成體血細(xì)胞分化相關(guān)，并且在血管新生過程中發(fā)揮著重要的作用.以往的工作顯示該基因編碼一個158氨基酸的蛋白質(zhì)，此蛋白不含結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域，但含有兩個串聯(lián)的特征性LIM結(jié)構(gòu)域.有證據(jù)表明LIM結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)

2、蛋白質(zhì)之間的相互作用，LM02蛋白作為橋梁分子將其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合到一起，在不同細(xì)胞中形成各種不同類型的復(fù)合體，進而調(diào)節(jié)特定下游靶基因的表達(dá)本實驗室的前期工作用正常成人腎組織mRNA為材料，結(jié)合新近發(fā)展的SMARTPCR及5RACE技術(shù)找到了Lmo2基因的一種新的5剪接模式.克隆到此剪接模式的全長cDNA并進行序列分析，發(fā)現(xiàn)這個新的轉(zhuǎn)錄本具有與以往不同的轉(zhuǎn)錄起始點，編碼一個151氨基酸的蛋Il質(zhì)，N$7個氨基酸序列與原先報道的LM02

3、蛋白有差異，其余則完全相同此外，在人類基因組序列數(shù)據(jù)庫中檢索Lmo2薈里宜至竺，經(jīng)過對原先報道的Lmo2mRNA序列修正后，找到符合原讀碼框的更上游的ATG起始密碼，其編碼產(chǎn)物在一直被廣泛認(rèn)同的LM02蛋白序列的N端增加了69個氨基酸。為進一步認(rèn)識這兩種新編碼蛋白表達(dá)特征及對其潛在結(jié)合因子的研究，本論文進行了以F幾個方面的工作:I以本實驗室先前構(gòu)建的PGEXQ載體為模板PCR，得到了原癌基因Lmo2最短剪接模式Lmo2一的開放讀碼框(O

4、RF)，將其作為插入片斷，利用基因工程方法構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNAMycHis6B中。此新構(gòu)建的載體稱為pcDNAMycHis6BLmo2Sa2提取本實驗室先前構(gòu)建的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系8511的cDNA，以其為模板PCR得到了原癌基因Lmo2最長剪接模式Lmo2L的開放讀碼框(ORF)，將其作為插入片斷，利用基因工程方法構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET中。此新構(gòu)建的載體稱為pETLmo2Lo3對構(gòu)建的pETLmo2L原核表達(dá)系統(tǒng)進行

5、誘導(dǎo)表達(dá)，得到了預(yù)期大小的目的蛋白。利用組氨酸與Ni“離子的鰲合作用親和層析，純化目的蛋白.關(guān)鍵詞Lmo2、原核表達(dá)載體匕真核表達(dá)載體、一蛋m—一一一一一一一止些F7c竺竺M41全(tx)論文ofLmo2andtheirpotentialpartnersthefollowingstudieshavebeenperformedinthisthesis:1TheshortORFofLmo2whichisacquiredthroughPCRf

6、romtheconstructedvectorpGEXQasthetemplatehasbeeninsertedintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNAMycHis6B.ThisnewconstructedvectoriscalledpcDNAMycHis6BLmo2S.2ThelongORFofLmo2whichisacquiredthroughPCRfromthecDNAofTALLcelllin

7、e8511asthetemplatehasbeeninsertedintotheprokaryoticexpressionvectorpET.ThisnewconstructedvectoriscalledpETLmo2L.3ExpectedinducedrecombinantproductwasobtainedfromtheconstructedprokaryoticexpressionvectorpETLmo2Landfurther