2型糖尿病患者膽固醇外流的功能改變及機制研究.pdf

1、2型糖尿病患者動脈粥樣硬化心腦血管疾病的發(fā)病率遠遠高于非2型糖尿病患者，其存在多重致動脈粥樣硬化因素，其中高密度脂蛋白(HDL)數量及其介導的膽固醇逆轉運功能異常在糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。巨噬細胞膽固醇外流是膽固醇逆轉運過程中的重要的初始步驟，本研究主要就膽固醇外流功能在2型糖尿病患者中的異常調節(jié)進行探討。
　　 研究目的：
　　 1.探討不同人群外周血單核巨噬細胞ABCA1、ABCG1的mRNA及蛋

2、白的表達情況。
　　 2.通過以HDL、ApoA1及血清為接受體，研究不同人群單核巨噬細胞的膽固醇外流功能。
　　 3.研究不同人群單核巨噬細胞的核因子肝X受體(LXR)的mRNA表達，同時通過電泳遷移率試驗探討LXR對ABCG1基因轉錄的調控作用。
　　 方法：
　　 1.按WHO診斷標準選取單純2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病患者，同時選取年齡與性別匹配的健康人群作為及正常對照組，抽取外周靜脈血40m

3、l，進行血脂、血糖等生化指標的檢測，ELISA血游離脂肪酸(FFA)水平。
　　 2.Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(PBMC)，免疫磁珠法分選單核細胞，M-CSF刺激培養(yǎng)使單核細胞巨噬化。油紅0及CD68免疫組化染色鑒定巨噬細胞。
　　 3.Real-TimePCR方法檢測人單核巨噬細胞上ABCA1、ABCG1的mRNA表達。
　　 4.WesternBlot方法檢測人單核巨噬細胞上的ABCA

4、1和ABCG1的蛋白表達。
　　 5.H3膽固醇標記巨噬細胞，以HDL為接受體，觀察以BLT-1阻斷SR-B1通路后經ABCG1通路的膽固醇外流；以apoAl為接受體，觀察經ABCA1通路的膽固醇外流；并以患者的自身血清和標準血清為接受體，觀察患者血清介導巨噬細胞的膽固醇外流能力的變化。
　　 6.用Real-TimePCR檢測核因子LXRα、LXRβ的mRNA表達水平。
　　 7.電泳遷移率試驗(EMSA)檢測

5、LXR與ABCG1啟動子區(qū)地LXRE結合的DNA結合蛋白的表達，從而探索LXR對ABCG1轉錄的影響。
　　 8.統(tǒng)計分析:采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以X±SD表示，組間比較以one-wayANOVA進行分析，線性相關應用Pearson's相關分析，回歸分析采用多重線性回歸分析方法。
　　 結果：
　　 1.受試者一般特征及生化指標概括:包括正常對照組15例，單純糖尿病組15例，糖尿病合并冠心

6、病組15例，共45例。單純糖尿病組與糖尿病合并冠心病組患者的空腹血糖水平顯著高于對照組，HbAlc水平高于正常值；單純糖尿病HDL-C、Hs-CRP低于正常對照組，余指標在各組間無顯著差異。
　　 2.Real-TimePCR檢測結果發(fā)現2型糖尿病患者ABCG1的mRNA表達水平顯著下調(2.26±0，86vs0.83±0.26，P<0.001)，而ABCA1的表達則無顯著改變(2.36±3.20vs2.34±2.88，P=0.

7、98)。ABCG1mRNA表達的多重線性回歸分析顯示:HbAlc與ABCG1的mRNA表達呈線性回歸關系，ABCG1的mRNA表達與HbAlc水平呈顯著負相關(r=-0.057，P=0.038)，HbAlc可能為ABCG1表達的重要影響因素。
　　 3.WesternBlot檢測結果發(fā)現2型糖尿病患者的ABCG1的蛋白表達水平也顯著下降，而ABCA1的蛋白表達在各組之間無顯著差異存在。
　　 4.HDL介導的經ABCG1

8、通路的膽同醇外流率及自身血清和標準血清介導的巨噬細胞膽固醇外流率在2型糖尿病患者中均顯著下降(P均<0.01)；而ApoA1介導的經ABCA1通路的膽固醇外流率在單純2型糖尿病患者中與對照組無明顯差異(P=0.09)，在糖尿病合并冠心病組患者卻顯著低于正常對照組(P=0.04)。
　　 5.Real-TimePCR檢測LXRa與LXRp的mRNA表達在正常對照組與2型糖尿病組之間未存在顯著差異(P=0.81，P=0.63)。

9、r>　　 6.EMSA檢測LXR與ABCG1啟動子結合的DNA結合蛋白的表達在2型糖尿病與正常對照組之間未發(fā)現顯著差異(P=0.16)。
　　 結論：
　　 1.在2型糖尿病患者中，巨噬細胞ABCG1的基因及蛋白表達顯著下降，而ABCA1的基因及蛋白表達則無明顯改變。
　　 2.2型糖尿病患者血清介導的巨噬細胞膽固醇外流能力明顯受損，以ABCG1通路介導的膽固醇外流下降為主，ABCA1通路介導的膽固醇外流在單純