一葉萩堿生物合成與生物轉化的研究.pdf

1、一葉萩堿是一種GABA受體特異性拮抗劑，具有顯著的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用，已經(jīng)成為神經(jīng)內(nèi)科重要的臨床用藥、及常用的工具藥。最新的研究結果還表明，一葉萩堿能顯著改善學習、記憶，有可能發(fā)展成為預防及治療老年性癡呆癥(AD)的藥物。除此之外，一葉萩堿還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗瘧、抗細菌、抗病毒等廣泛的生物活性。因此，近年來關于一葉萩生物堿的研究增長很快。一葉萩堿在一葉萩植物中的生物合成顯示了十分獨特的旋光現(xiàn)象：不同地區(qū)的同種一葉萩植物能特異地生物合

2、成不同旋光的一葉萩堿。另外，一葉萩堿化學結構的剛性和手性使得化學全合成和化學衍生難度很大。因此，對一葉萩生物堿手性生物合成機理的研究無疑具有重要的理論意義和應用價值。本文對一葉萩堿生物合成及生物轉化進行了研究，包括以下四個方面的工作內(nèi)容： 1.一葉萩植物愈傷組織的培養(yǎng)和一葉萩堿的積累采集了三個不同來源——河北省興隆縣、北京市密云縣、北京市房山區(qū)上方山的一葉萩植物，誘導獲得了三個一葉萩愈傷組織的細胞株。確定了適合組織培養(yǎng)樣品處理及

3、其一葉萩堿含量的RP-HPLC分析方法。通過多種波譜學手段確證了誘導自北京市密云縣的一葉萩愈傷組織中積累右旋一葉萩堿；建立了應用一種手性溶解劑(S)-(-)-N-鄰苯二甲酰丙氨酸((S)-(-)-N-Phthalylalanine)鑒定一葉萩堿樣品光學純度的方法。對影響愈傷組織生物量積累及一葉萩堿含量的多個因素——光照、基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、激素配比等進行了研究。結果表明，光照、MS基本培養(yǎng)基、5％蔗糖濃度、16.11μMNAA和2.3

4、2μMKT的激素配比為愈傷組織生長和一葉萩堿積累的最適條件。 2.一葉萩植物愈傷組織的化學成分從一葉萩愈傷組織培養(yǎng)物中，通過常壓硅膠柱層析、制備薄層、凝膠分離及半制備HPLC等分離手段，共得到24個化合物，分別是：3β，12-二羥基-13-甲基6，8，11，13-羅漢松四烯(3β，12-dihydroxy-13-methyl-6，8，11，13-podocarpatetraen)(1)，3β，12-二羥基-13-甲基-5,8,1

5、1，13-羅漢松四烯-7-酮(3β，12-dihydroxy-13-methyl-5,11，13-podocarpatetraen-7-one)(2)，20(10→5)-阿貝-4,5-開環(huán)-5(10),6,8,11，13-羅漢松五烯-3-酮(20(10→5)-abeo-4,5-seco-5(10)，6，8，11，13-podocarpapentaen-3-one)(3)，右旋一葉萩堿(virosecurinine)(4)，右旋別一葉萩堿

6、(viroallosecurinine)(5)，14,15-二氫右旋一葉萩堿(14,15-dihydrovirosecurinine)(6)，ent-Phyllanthidine(7)，SecurinolA(8)，2,8-epi-SecurinolA(9)，山柰酚(kaempferol)(10)，山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-β-D-rutinoside)(11)，蘆丁(rutin)(12)，β-谷甾醇

7、(β-sitosterol)和β-豆甾醇(β-stigmasterol)混合物(13、14)，胡蘿卜甙(daucosterol)、豆甾醇葡萄糖甙(stigmasterolglucoside)混合物(15、16)，SitoindosideI(stigmast-5-en-3-ol-O-(6-O-hexadecanoyl--D-glucopyranoside)和Stigmast-7,22-dien-3-ol-O-(6-O-hexadecano

8、yl--D-glucopyranoside)混合物(17、18)，(-)-Dihydroaquilegiolide(19)，鄰羥基苯乙酸(2-hydroxyphenylaceticacid)(20)，對羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylaceticacid)(21)，半乳糖醇(galactitol)(22)，三十四烷醇(tetratriacontanol)(23)，三十二烷酸(dotriacontanoicacid)(24)。其

9、中化合物1、2、3為新化合物，藥理活性篩選結果顯示，這3個化合物均具有一定的細胞毒活性。 3.一葉萩堿的生物合成途徑研究由一葉萩愈傷組織培養(yǎng)物中分離得到了化合物(-)-dihydroaquilegiolide和對羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylaceticacid)這兩個化合物結構提供的線索，結合前人的研究基礎，通過理論分析，提出了一條新的一葉萩生物堿可能的生物合成途徑，即從酪氨酸氧化到對羥基苯丙酮酸，再脫羧形成對羥基

10、扁桃酸，對羥基扁桃酸通過一個醌甲基中間體生物合成aquilegiolide，aquilegiolide與來源于賴氨酸的△1-piperdine通過一個Mannich-like關鍵反應連接一葉萩堿的A環(huán)與C/D環(huán)。并對這一假設生物合成途徑的兩個關鍵中間體——aquilegiolide和對羥基扁桃酸(p-hydroxymandelicacid)與一葉萩堿的生物合成關系進行了試驗探索。試驗了酸、堿、鈀催化的對羥基扁桃酸穩(wěn)定同位素標記方法，并通

11、過氘代苯酚與乙醛酸的間接方法，制備了3′，5′-氘二取代的對羥基扁桃酸，其3′，5′位的氘代比例達63％。將氘代標記的對羥基扁桃酸投入一葉萩植物細胞懸浮培養(yǎng)中，LC-MS分析其中一葉萩堿生物合成的結果顯示，約7％的一葉萩堿中摻入了氘代的對羥基扁桃酸前體，結果有利于提出的生物合成假設。 4.一葉萩堿的微生物轉化從河北興隆縣和北京房山區(qū)上方山采集的一葉萩植物中制備了一葉萩堿的4個異構體(左旋一葉萩堿securinine，左旋別一葉萩

12、堿allosecurinine，右旋一葉萩堿virosecurinine，右旋別一葉萩堿viroallosecurinine)。對73株不同來源的微生物轉化左旋一葉萩堿的能力進行了篩選，得到5株具有轉化能力的絲狀真菌。其中一株分離自一葉萩植物的內(nèi)生真菌葉2轉化左旋一葉萩堿得到兩個產(chǎn)物，為新化合物14,15-二氫-5α-羥基左旋一葉萩堿(7)，已知化合物14,15-二氫左旋一葉萩堿(8)；葉2同時可以對一葉萩堿的另外3個異構體進行轉化，并

13、分別得到其對應的14,15雙鍵還原產(chǎn)物——14,15-二氫左旋別一葉萩堿(9)，14，15-二氫右旋別一葉萩堿(10)，14,15-二氫右旋一葉萩堿(11)，其中14，15-二氫右旋別一葉萩堿(10)為新化合物。4株微生物轉化一葉萩堿4種異構體的結果顯示，這4個微生物只能將左旋一葉萩堿和左旋別一葉萩堿轉化為對應的14,15雙鍵還原產(chǎn)物，而對右旋一葉萩堿和右旋別一葉萩堿不能轉化。對一葉萩堿14,15位雙鍵還原的轉化酶的初步研究表明，這個酶