RNA-SEQ BASED TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF A HIGHLY RESISTANT AND VIRULENT METHICILLIn-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種感染人和動(dòng)物的重要的食源性機(jī)會(huì)致病菌，它可以引起菌血癥，肺炎和軟組織感染，引起很高的發(fā)病率和死亡率，給健康帶來嚴(yán)重的威脅。金黃色葡萄球菌具有廣泛的宿主包括人，家畜，禽類，寵物和野生動(dòng)物。傳染性的病原菌可以通過動(dòng)物源性食品傳播擴(kuò)散，給公眾健康造成威脅。動(dòng)物源性的金黃色葡萄球菌對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物均不敏感，在此基礎(chǔ)之上出現(xiàn)并擴(kuò)散的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是目前最主要的問題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在持續(xù)不斷地進(jìn)化，對(duì)

2、好幾種抗生素的耐藥性也在不斷增加，導(dǎo)致了臨床上抗生素治療的失敗。耐藥菌含有許多可移動(dòng)的遺傳元件，這些遺傳元件確保細(xì)菌在不斷變化的環(huán)境中通過水平基因的轉(zhuǎn)移來進(jìn)化。一些調(diào)控基因控制著各種耐藥和毒力因子的表達(dá)，且理解其調(diào)控機(jī)制是非常重要的。針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株在動(dòng)物及動(dòng)物源性食品產(chǎn)品的普及率的研究已經(jīng)展開，但關(guān)于其毒力和相關(guān)基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)還是有限的。所以，本研究目的在于通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法尋找高毒力和高耐藥的菌株，并

3、對(duì)其耐藥與毒力機(jī)制進(jìn)行研究。
　　在第一項(xiàng)研究中，MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌動(dòng)物毒力株通過體外瓊脂稀釋法，生物膜形成，粘附，侵襲和細(xì)胞內(nèi)生存性分析檢驗(yàn)。此外，這些菌株的致病性進(jìn)行了在小鼠金黃色葡萄球菌敗血癥模型的檢查。MRSA1679a是從雞中分離出的菌株，觀察得出它是非常致命的，在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型中具有廣泛的耐藥性。
　　第二項(xiàng)研究中，為了鑒定可能參與毒力和多重耐藥性的相關(guān)基因，我們對(duì)高毒力動(dòng)物傳染性的耐甲氧西

4、林分離株和人類參考菌株(ATCC29313)進(jìn)行了基于Illumina公司的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序得到了許多差異基因并對(duì)其進(jìn)行了定量RT-PCR分析。在測(cè)序結(jié)果中，毒力因子如粘附因子和囊蛋白的表達(dá)高度上調(diào)，而那些毒素和胞外酶的表達(dá)下調(diào)。生物膜相關(guān)的基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株中高度表達(dá)。毒力的關(guān)鍵調(diào)控因子如sarA和kdpDE的表達(dá)也有所上調(diào)，并且，它們似乎在抑制外毒素，誘導(dǎo)粘附和細(xì)胞壁蛋白產(chǎn)生強(qiáng)生物膜中發(fā)揮著重要的作用。除了耐藥基因如

5、blaZ，ermC和femA，vraS和多藥ABC，轉(zhuǎn)運(yùn)基因的上調(diào)也導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的多重耐藥。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類的耐藥主要因?yàn)間yrA和parC基因的突變。除了幾個(gè)與應(yīng)激相關(guān)的基因，許多碳水化合物代謝基因的表達(dá)量也很高，這反映了細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)。許多可移動(dòng)的遺傳元件也有差異表達(dá)，并且對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥和毒力有一定的調(diào)控作用。
　　我們對(duì)MRSA1679a和ATCC29213的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比分析結(jié)

6、果表明金黃色葡萄球菌中許多毒力與耐藥決定因子受到復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。這些因子的表達(dá)根據(jù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的環(huán)境條件而改變，其中SarA是最重要的一個(gè)調(diào)控因子，它增加了細(xì)菌的致病性，并且確保細(xì)菌能在不同的環(huán)境中生存。此外，可移動(dòng)的遺傳元件也影響許多基因的表達(dá)，并最終影響金黃色葡萄球菌的表型特征?；谖覀兊谝粋€(gè)研究，第二個(gè)轉(zhuǎn)錄組研究的目的是通過全基因表達(dá)分析了解高毒力和耐藥菌株MRSA1679a在亞抑菌濃度（1/2頭孢喹肟MIC）下的響應(yīng)。
　　頭

7、孢喹肟是第四代頭孢菌素，特別為獸醫(yī)學(xué)而研制。世界各地的很多國(guó)家已經(jīng)注冊(cè)并用于許多疾病的治療，如呼吸道疾病，牛腳腐病和急性乳腺炎，小牛敗血癥，馬呼吸道病和小馬敗血癥等。由于MRSA耐頭孢喹肟機(jī)制還需要深入探究，我們?cè)O(shè)計(jì)了這個(gè)檢測(cè)分析頭孢喹肟對(duì)MRSA1679a轉(zhuǎn)錄的影響的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中家禽菌株用頭孢喹肟亞抑菌濃度處理后，再與原始野生菌株比較它們的轉(zhuǎn)錄組變化。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，外排泵（QacA、NorB、Bcr、ABCb）在MRSA1679

8、a中上調(diào)，才表現(xiàn)出頭孢喹肟的耐藥特性。為了抵抗這種β-內(nèi)酰胺類抗生素，青霉素結(jié)合蛋白表現(xiàn)出過度表達(dá)。MRSA的粘附和生物膜形成能力出現(xiàn)增強(qiáng)，以便于應(yīng)激基因的過度表達(dá)。同時(shí)碳水化合物的代謝、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)活性也有顯著增加。作為一個(gè)整體，細(xì)菌的基因組合力克服由頭孢喹肟帶來的逆境，在充滿挑戰(zhàn)的生存環(huán)境中表現(xiàn)出了極大的遺傳潛力。因此，這項(xiàng)研究讓我們深刻認(rèn)識(shí)到MRSA1679a成為重要病原體的潛力以及MRSA耐頭孢喹肟的模式。當(dāng)然進(jìn)一步系統(tǒng)地通過分子