VEGFR胞外結(jié)合域（KDR3）基因的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，抗血管生成療法是一個(gè)正在興起的腫瘤生物治療的新途徑。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是最主要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與受體的相互作用刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。由于人VEGFRII(KDR)編碼1354個(gè)氨基酸，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和功能研究存在一定難度，因而選取其主要功能部位進(jìn)行研究。已有的實(shí)驗(yàn)提示在其7個(gè)免疫球蛋白區(qū)域中區(qū)域3對(duì)于VEGF的結(jié)合貢獻(xiàn)最突出。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)查閱參考文獻(xiàn)及利用計(jì)算機(jī)分

2、子模擬系統(tǒng)對(duì)KDR3與VEGF的結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了分析，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了三個(gè)KDR3突變體：M1、M2、M3。首先，從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA，利用RT-PCR方法克隆了人KDR3成熟肽的cDNA序列，利用重疊延伸PCR方法獲得了各突變體的DNA片段。然后，將它們分別插入pET-His載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用E．coliBL21進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果表明相應(yīng)工程菌目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)洗滌后以Sepha

3、cryl-200凝膠柱層析進(jìn)行純化，純化蛋白在還原型和氧化型谷胱甘肽組成的氧化還原體系中進(jìn)行復(fù)性，獲得了純度達(dá)90％以上野生型及突變體KDR3的蛋白純品，為可溶性受體治療腫瘤打下基礎(chǔ)。 最后，構(gòu)建誘餌蛋白載體PAS2-1一KDR3及目的蛋白載體PACT-2-VEGF，并分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y190中，對(duì)KDR3及VEGF分析，結(jié)果表明二者均不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在酵母系統(tǒng)中驗(yàn)證KDR3和VEGF的相互作用，結(jié)果未能檢測(cè)到兩者的相互作