仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架的生物學(xué)性能及修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、組織、器官的喪失或功能障礙是人類健康所面臨的主要危害之一，也是人類疾病和死亡的最主要原因之一。骨缺損、骨不連的修復(fù)，一直是骨科領(lǐng)域的棘手問題，人們采用許多修復(fù)辦法如自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨移植、金屬材料、陶瓷及人工合成的高分子材料等來修復(fù)骨缺損，但是它們都有各自的缺陷。如供體來源有限、免疫排異反應(yīng)、難以降解、有毒及其它副反應(yīng)。近年來設(shè)計(jì)仿生骨基質(zhì)材料，為解決骨缺損及不連修復(fù)提供了全新的修復(fù)辦法，它己滲入到骨科各個(gè)領(lǐng)域，成為國內(nèi)

2、外研究的熱點(diǎn)之一。 天然骨基質(zhì)是由無機(jī)礦物和生物大分子排列所組成的復(fù)合體，前者主要為羥基磷灰石，后者主要為膠原蛋白和少量多糖，兩者極為均勻一致、有序結(jié)合在一起。仿生骨基質(zhì)材料就是設(shè)計(jì)一種具有和天然骨基質(zhì)類似的結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)仿生)和功能(功能仿生)的骨基質(zhì)材料。這種仿生骨基質(zhì)材料應(yīng)在體內(nèi)可降解，無毒性及其它不良反應(yīng)，而且通過它降解誘導(dǎo)礦化的形成，能分化為成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的干細(xì)胞在仿生骨基質(zhì)材料表面及內(nèi)部可定向分化形成活骨組織。仿生骨

3、基質(zhì)材料是細(xì)胞生活的微環(huán)境，是為細(xì)胞分化增殖提供支撐、營養(yǎng)的必不可少的條件之一，它一般應(yīng)具備以下條件：(1)良好的生物相容性；(2)優(yōu)良的生物可降解性；(3)具有三維多孔的立體結(jié)構(gòu)特性；(4)具有一定的可展性和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度；(5)良好的細(xì)胞——材料界面特性；(6)無毒性，無免疫反應(yīng)性。 為了研制一種理想的仿生型骨修復(fù)材料，本課題在綜合分析大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選用化學(xué)組成與生物體的自然骨骼相似、容易與周圍的骨骼形成緊密牢固的化學(xué)鍵

4、合、經(jīng)生物降解形成新的骨骼成分、具有良好生物相容性和骨傳導(dǎo)性的生物活性玻璃(Bioactiveglass，BG)作為復(fù)合支架的基體，與天然骨基質(zhì)主要成分中的Ⅰ型膠原(Collagen，COL)、透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HYA)和磷酸絲氨酸(Phosphoserine，PS)交聯(lián)，利用冷凍干燥技術(shù)，制備成BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架，通過體內(nèi)外系列實(shí)驗(yàn)研究觀察其理化性能、生物相容性及其誘導(dǎo)、傳導(dǎo)成骨能力。 實(shí)

5、驗(yàn)分三個(gè)部分進(jìn)行觀察研究： (一)仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架材料的制備及性能表征研究。采用溶膠-凝膠方法制備58S生物活性玻璃(58SBG)，將生物活性玻璃納米粉體、Ⅰ型膠原蛋白，透明質(zhì)酸和磷酸絲氨酸按比例混合、交聯(lián)、冷凍干燥，制成BG-COL-HYA-PS、BG-COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL復(fù)合支架材料。應(yīng)用掃描電鏡(SEM)觀察復(fù)合支架的顯微形貌、孔徑，測量孔隙率；利用三點(diǎn)彎曲強(qiáng)度測試評(píng)價(jià)復(fù)

6、合支架的機(jī)械性能；以磷酸鹽溶液(PBS)為浸透介質(zhì)進(jìn)行膨脹動(dòng)力學(xué)測試。 (二)仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架材料的生物相容性檢測。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將小鼠胚胎成骨細(xì)胞種植于BG-COL-HYA-PS、BG-COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL復(fù)合材料和58SBG上，用MTT法、ALP活性測定、倒置光相差顯微鏡和掃描電鏡(SEM)等觀察細(xì)胞在材料中的生長情況和相互關(guān)系。參照GB/T16886.5-1997

7、-ISO10993-5：1992對(duì)醫(yī)用植入材料的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和所推薦的生物學(xué)及動(dòng)物試驗(yàn)，選用健康昆明系小鼠60只進(jìn)行生物相容性實(shí)驗(yàn)。以不同濃度的材料浸提液加入動(dòng)物血樣中，用分光光度計(jì)測取各自的吸光度并算出相應(yīng)的溶血率，以評(píng)價(jià)材料的血液相容性；通過在動(dòng)物尾靜脈注射不同濃度梯度的復(fù)合材料浸提液，在規(guī)定的觀察期內(nèi)觀察材料可能引起的急性毒性反應(yīng)。以評(píng)價(jià)復(fù)合材料的生物安全性。 (三)仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)

8、研究。選用健康成年新西蘭大白兔68只136側(cè)橈骨制作節(jié)段性骨缺損(中段帶骨膜10mm骨缺損)模型，將BG-COL-HYA-PS、BG-COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL復(fù)合材料和58SBG植入骨缺損處，另做不植入任何材料的骨缺損為空白對(duì)照。術(shù)后2、4、8和12周時(shí)攝X片，并取材做組織形態(tài)學(xué)、掃描電鏡觀察；術(shù)后4、12周進(jìn)行骨密度、礦化沉積率(Mineralappositionrate)和骨形成率(Boneformation

9、rate)檢測，評(píng)價(jià)BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架材料修復(fù)骨缺損的能力。 運(yùn)用SPSS13.0軟件，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)方差分析(analysisoffactorialdesign)，觀察各項(xiàng)指標(biāo)的差別變化。 實(shí)驗(yàn)獲得以下主要結(jié)果和結(jié)論： 1、仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架材料的制備及性能表征研究。 SEM顯微形貌顯示BG-COL-HYA-PS、BG-

10、COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL四種復(fù)合支架均具有相互交錯(cuò)、連續(xù)的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)?？讖酱笮≡趲孜⒚椎?00μm間分布。-30℃冷凍干燥后孔隙率為87.5％。與BG-COL支架相比，BG-COL-HYA-PS網(wǎng)絡(luò)支架具有更緊密的結(jié)構(gòu)，生物玻璃顆粒包裹在膠原蛋白-透明質(zhì)酸-磷酸絲氨酸復(fù)合聚合物中，顆粒間通過纖維狀的有機(jī)大分子相連；相比之下，在BG-COL支架中，生物玻璃顆粒僅有很少一部分被膠原基質(zhì)包覆。采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)法分析

11、BG-COL、BG-COL-HYA、BG-COL-PS、BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架的機(jī)械性能，測試結(jié)果顯示BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架的斷裂強(qiáng)度(Strengthatbreak)為1.302±0.014MPa，是BG-COL的1.75倍；彈性模量(Elasticmodulus)為37.522±0.012kPa，是BG-COL的7.50倍；且都高于BG-COL-HYA和BG-COL-PS組，單因素方差分析P值＜0.0005。

12、說明BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架具有較高的韌性。膨脹和浸析試驗(yàn)表明，不同的復(fù)合支架在浸泡過程中具有不同的體積變化。BG-COL支架在PBS溶液中浸泡1小時(shí)后幾乎達(dá)到飽和，3天后完全瓦解。而含有透明質(zhì)酸和磷酸絲氨酸的BG-COL-HYA、BG-COL-PS、BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架在PBS中浸泡3天仍保持著緊密結(jié)構(gòu)，甚至10天之后也未瓦解。由于膠原蛋白、透明質(zhì)酸、磷酸絲氨酸，三種生物分子之間的協(xié)同作用，BG-COL-HYA

13、-PS復(fù)合支架較BG-COL、BG-COL-HYA、BG-COL-PS具有更高的濕態(tài)力學(xué)性能及形態(tài)穩(wěn)定性。 2、仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架材料的生物相容性檢測。 倒置顯微鏡、掃描電鏡、ALP染色顯示成骨細(xì)胞在BG-COL-HYA-PS、BG-COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL四種材料上能良好粘附、增殖，并向支架孔內(nèi)生長，用倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞與不同的支架聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)生長情況可以觀察

14、到細(xì)胞具有明顯向材料聚集的流向生長趨勢。而在58SBG材料上粘附差、細(xì)胞逐漸死亡；MTT法結(jié)果顯示：聯(lián)合培養(yǎng)后1天，BG-COL-HYA-PS組的OD值為0.314±0.004，5天時(shí)達(dá)到0.621±0.002，分別為58SBG組的1.49倍和1.44倍；同時(shí)，細(xì)胞活性也明顯優(yōu)于BG-COL-PS、BG-COL-HYA和BG-COL組(重復(fù)測量方差分析顯示，不同實(shí)驗(yàn)組F值=4420.499，P值＜0.05)。聯(lián)合培養(yǎng)3天時(shí)，BG-COL

15、-HYA-PS組ALP活性檢測結(jié)果為152±3，是58SBG組的1.39倍，且明顯高于BG-COL-HYA和BG-COL組(重復(fù)測量方差分析顯示，不同實(shí)驗(yàn)組F值=209.274，P值＜0.05)。BG-COL-HYA-PS、BG-COL-PS、BG-COL-HYA、BG-COL四種材料浸提液注入動(dòng)物體內(nèi)的急性毒性反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果依據(jù)規(guī)定的判定標(biāo)準(zhǔn)判定為無毒性；不同濃度的材料浸提液與血液混合后溶血率均小于3％，低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的5％。說明仿生復(fù)合

16、材料BG-COL-HYA-PS具有良好的骨細(xì)胞相容性和生物安全性。 3、仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。 組織切片和掃描電鏡顯示：仿生型復(fù)合材料BG-COL-HYA-PS植入2周，孔穴內(nèi)見大量成骨細(xì)胞、纖維組織和新生血管長入。4周后，X線和組織切片顯示植入?yún)^(qū)有大量編織骨組織及類骨質(zhì)形成。8周缺損處兩斷端間形成新骨橋接，骨皮質(zhì)連接完整。12周缺損完全修復(fù)，髓腔基本再通。58SBG組12周時(shí)

17、有少量骨痂形成；空白對(duì)照組12周時(shí)缺損清晰，骨不連征象明顯。連續(xù)的組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，仿生型復(fù)合支架內(nèi)新骨形成是自支架周圍向其中央逐步形成，這一現(xiàn)象說明材料具有良好的骨傳導(dǎo)性。BG-COL-HYA-PS組和BG-COL-PS組的掃描電鏡顯示，植入缺損后2周即可見明顯的鈣鹽顆粒沉積。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，仿生型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架具有：緊密有序、三維多孔的顯微結(jié)構(gòu)；優(yōu)越的濕態(tài)力學(xué)性能及形態(tài)穩(wěn)定性；良好的生物相容性、生物