MAFbx-Atrogin-1和MuRF1在大鼠肌肉游離移植模型中的表達(dá)和意義.pdf

1、本課題擬通過建立吻合血管神經(jīng)的游離肌肉移植動(dòng)物模型，采用組織形態(tài)學(xué)、電生理、免疫組化、Real-time PCR、Western blot等方法，對(duì)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在大鼠肌肉游離移植模型中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及其與肌肉萎縮狀況的相關(guān)性進(jìn)行研究，從而為闡明肌肉移植后功能降低的潛在機(jī)制及防治肌肉的萎縮提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的： (1)建立大鼠股薄肌原位游離移植的模型，并評(píng)測(cè)各項(xiàng)描述肌肉萎縮的相關(guān)

2、指標(biāo)； (2)觀測(cè)術(shù)后不同時(shí)段MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在肌肉內(nèi)mRNA的表達(dá)，探討其與肌肉萎縮的相關(guān)性； (3)觀測(cè)肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在術(shù)后不同時(shí)段蛋白水平的變化，探討其與肌肉萎縮的相關(guān)性； (4)探討肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRFl活化的可能機(jī)制。 方法： (1)建立大鼠單側(cè)吻合血管神經(jīng)的股薄肌原位游離移植動(dòng)物模型，并按術(shù)后觀察時(shí)間

3、段的不向，分為術(shù)后1周、2周、3周、4周、5周、10周、15周、20周和30周組； (2)術(shù)后不同時(shí)間段的肌肉測(cè)量濕重，及移植側(cè)肌濕重/對(duì)照側(cè)肌濕重×100％，得出肌濕重維持率； (3)不同時(shí)間段移植側(cè)和對(duì)照側(cè)的肌肉近、中、遠(yuǎn)段組織做10μm橫切片，然后行HE染色，顯微鏡下拍照后。用NIH Image J v1.36軟件分析測(cè)量肌細(xì)胞直徑及截面積； (4)生理記錄儀分別測(cè)試各組移植前后的最大單收縮力和最大強(qiáng)直收縮

4、力。每側(cè)收縮力所得數(shù)值按移植后/移植前×100％計(jì)算，得出各組肌肉的恢復(fù)程度； (5)參考大鼠MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因編碼序列，采用PrimerPremier軟件設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物。采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)移植后不同時(shí)間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的轉(zhuǎn)錄水平，各組以GAPDH為內(nèi)參； (6)Western Blot檢測(cè)移植后不同時(shí)間肌肉內(nèi)MAF

5、bx/Atrogin-1蛋白的變化，各組以GAPDH為內(nèi)參；(7)SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)移植術(shù)后不同時(shí)間IGF1 mRNA表達(dá)的變化；各組以GAPDH為內(nèi)參。 結(jié)果： (1)成功構(gòu)建了吻合血管神經(jīng)的大鼠股薄肌游離移植動(dòng)物模型，各分組大鼠成活良好，無一死亡，獲取肌肉標(biāo)本無感染跡象。 (2)肌肉移植后，肌濕重維持率(移植側(cè)肌濕重/對(duì)照側(cè)肌濕重×100％)，先降低后增加，在術(shù)后第4周最低，達(dá)(59.

6、3±5.2)％，但到術(shù)后晚期時(shí)仍低于對(duì)照組的水平(P<0.05)。 (3)術(shù)后肌細(xì)胞橫截面積呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，先逐漸變小，至術(shù)后第四周時(shí)最低，然后又逐漸增加，同樣到術(shù)后30周時(shí)仍未恢復(fù)到術(shù)前對(duì)照組水平。 (4)測(cè)得術(shù)后移植肌肉的最大單收縮力和最大強(qiáng)直收縮力，與對(duì)照側(cè)比較得出肌肉功能恢復(fù)率后發(fā)現(xiàn)，與肌濕重維持率和肌細(xì)胞橫截面積的變化具有類似的趨勢(shì)。 (5)設(shè)計(jì)并合成了SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)所需的M

7、AFbx/Atrogin-1、MuRF1及GAPDH引物，通過常規(guī)PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無引物二聚體產(chǎn)生，引物特異性強(qiáng)。 (6)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，通過2<'-△△Cr>法計(jì)算移植后不同時(shí)間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)MuRFl mRNA表達(dá)的相對(duì)量在術(shù)后逐漸增高，最高達(dá)3周時(shí)的4倍，而MAFbx/Atrogin-1 mRNA在術(shù)后的表達(dá)更為激烈，最到達(dá)2-3周時(shí)的7倍之多。

8、至術(shù)后15周時(shí)開始，MAFbx/Atrogin-1和MuRF1mRNA表達(dá)的相對(duì)量從最高又逐漸下降，開始為低度(1.1～1.5倍)高水平表達(dá)，但與對(duì)照側(cè)相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。發(fā)現(xiàn)MuRF1 mRNA表達(dá)的相對(duì)量在術(shù)后逐漸增高，最高達(dá)4周時(shí)的4倍，后逐漸較少，至術(shù)后15周開始為低度高水平表達(dá)；而MAFbx/Atrogin-1mRNA在術(shù)后的表達(dá)更為激烈，最高達(dá)到2-3周時(shí)的7倍之多，至術(shù)后15周也減少為低度的高水平表達(dá)。

9、 (7)Western Blot檢測(cè)移植后不同時(shí)間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)所有肌肉標(biāo)本的Western結(jié)果中，在分子量約為43KD的區(qū)域都可見MAFbx/Atrogin-1的蛋白條帶。以正常對(duì)照側(cè)肌肉內(nèi)目的蛋白表達(dá)量為對(duì)照，術(shù)后1周表達(dá)量有所下降，術(shù)后2周開始上升，4周左右達(dá)到最高，約正常對(duì)照的2.5倍。然后開始減少，術(shù)后15周時(shí)表達(dá)量仍較高，約為正常對(duì)照的1.35倍且與對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05

10、)，但到術(shù)后30周時(shí)移植的股薄肌內(nèi)的MAFbx/Atrogin-1蛋白表達(dá)量已與正常對(duì)照基本持平(P>0.05)。 (8)Realtime PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后IGF1 mRNA表達(dá)先降低后增高，與MAFbx/Atrogin-1和MuRF1mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)相反。 結(jié)論： (1)所構(gòu)建的吻合血管神經(jīng)的大鼠股薄肌游離移植動(dòng)物模型符合研究需要，肌肉移植后肌濕重維持率和肌細(xì)胞橫截面積先呈現(xiàn)典型肌萎縮后表現(xiàn)，后隨神經(jīng)

11、的再支配，萎縮逐漸好轉(zhuǎn)，但至術(shù)后30周時(shí)仍未恢復(fù)到術(shù)前對(duì)照組水平； (2)用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，測(cè)量mRNA的表達(dá)相對(duì)量的方法可靠，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好；該方法檢測(cè)到的肌肉移植后MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的表達(dá)變化，與肌肉游離移植后的萎縮及功能降低有密切關(guān)系； (3)Western Blot發(fā)現(xiàn)MAFbx/Atrogin-1蛋白有類似的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步證明了其與移植后肌萎縮