丹寧酸對經(jīng)戊二醛固定的牛頸靜脈帶瓣管道的改性研究.pdf

1、近年來，經(jīng)戊二醛固定的牛頸靜脈作為一種新型的帶瓣管道逐漸用于右室流出道重建術(shù)，并獲得較好的短、中期臨床療效。但該管道失功或衰敗率依然偏高，主要原因有吻合口狹窄、管壁瘤樣擴(kuò)張、管壁組織鈣化及血栓形成等。管道交聯(lián)劑戊二醛的缺陷可能與此有關(guān)。若能有效彌補(bǔ)戊二醛的不足，可降低管道相關(guān)并發(fā)癥，并由此提高其耐久性和使用壽命。本文對戊二醛固定的牛頸靜脈管道實(shí)施丹寧酸改性處理。 第一部分：大鼠皮下埋植模型評價(jià)丹寧酸的抗鈣化、抗炎和彈力纖維保護(hù)作

2、用及其機(jī)理研究。 目的：評價(jià)丹寧酸改性處理對戊二醛固定的牛頸靜脈管道彈力纖維、鈣化和炎癥反應(yīng)的影響，并初步探討其作用機(jī)理。 方法：新鮮牛頸靜脈血管壁材料分別經(jīng)戊二醛(對照組)或戊二醛/丹寧酸(實(shí)驗(yàn)組)交聯(lián)處理后，埋植于3周齡SD大鼠皮下，21天及60天后分批取出。取出的標(biāo)本分三部分分別行下列檢查：(1)鈣及彈性蛋白含量測定；(2)組織學(xué)檢查，包括H&E染色、yon Kossa染色、Masson三色染色以及van-Gies

3、on染色分別觀察管壁鈣鹽沉積、膠原纖維及彈力纖維降解情況；免疫組織化學(xué)法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和TN-C表達(dá)；(3)逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定管壁MMP-9及TN-C的基因表達(dá)。 結(jié)果：在整個(gè)埋植過程中，戊二醛/丹寧酸組牛頸靜脈管壁鈣含量(第21天2.91±0.82 mg/g干重vs.35.03±9.58 mg/g干重，p<0.01；第60天：6.64±1.91mg/g干重vs.111.56±19.

4、80 mg/g干重，p<0.01)及彈性蛋白丟失量(殘留纖維：第21天：112.9±12.8 mg/g干重vs.54.8±12.0 mg/g干重，p<0.01；第60天：97.6±9.8 mg/g干重vs.19.6±7.8mg/g干重，p<0.01)均明顯低于戊二醛組。同期組織學(xué)檢查結(jié)果與此相一致。此外，在埋植第21天，戊二醛/丹寧酸組管壁炎性細(xì)胞浸潤程度(p<0.05)和MMP-9、TN-C的mRNA表達(dá)量(p<0.05)均少于戊二醛

5、組。 結(jié)論：丹寧酸改性處理有效降低戊二醛固定的牛頸靜脈血管壁的鈣化、炎癥反應(yīng)以及彈力纖維降解程度。其中，丹寧酸的抗鈣化作用可能與其穩(wěn)定彈力纖維、抗炎反應(yīng)以及抑制MMP-9、TN-C表達(dá)等因素有關(guān)。 第二部分：理化性質(zhì)、血液相容性及生物相容性評價(jià)。 目的：從材料理化性質(zhì)、血液相容性及生物相容性三方面，評價(jià)丹寧酸改性處理對戊二醛固定的牛頸靜脈管道的影響，為下一步的動物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 方法：新鮮牛頸靜脈血管壁材料

6、分別經(jīng)戊二醛(對照組)和戊二醛/丹寧酸(實(shí)驗(yàn)組1交聯(lián)處理后，行以下評價(jià)：(1)理化性質(zhì)方面：包括熱收縮溫度測定、抗膠原蛋白酶及抗彈性蛋白酶酶解能力測定、生物力學(xué)性能測定以及傅立葉變換紅外線光譜法檢查；(2)血液相容性方面：包括體外動態(tài)凝血實(shí)驗(yàn)、血小板黏附性能實(shí)驗(yàn)、D-二聚體測定和補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)；(3)生物相容性方面：此部分只針對戊二醛/丹寧酸組牛頸靜脈血管材料，按國家醫(yī)用材料的要求制備該材料的浸提液，后者行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、過敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激

7、試驗(yàn)、原發(fā)性皮膚刺激試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)以及熱原試驗(yàn)等檢測。 結(jié)果：與戊二醛組相比，戊二醛/丹寧酸組牛頸靜脈血管壁材料理化性質(zhì)及血液相容性有明顯改變，表現(xiàn)為：(1)理化性質(zhì)方面：①熱收縮溫度升高(88.83±O.16℃ vs.90.77±1.26℃，p<0.01)，②抗膠原纖維酶(被酶解組織含量：31.28±5.16％vs.8.55±4.54％，p<0.01)及抗彈性蛋白酶(被酶解組織含量：18.34±5.97％vs

8、.4.83±2.16％，p<0.01)酶解性能增強(qiáng)；③血管壁最大拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率增加；④丹寧酸結(jié)合到管壁組織中；(2)血液相容性方面：①抗凝血性能增強(qiáng)；②血小板黏附顯著減輕；③D-二聚體含量各組均在正常范圍內(nèi)，丹寧酸處理前后無顯著性差異(p>0.05)；④補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)體C3a水平降低(p<0.05)。此外，戊二醛/丹寧酸組血管材料生物相容性評價(jià)結(jié)果顯示：①培養(yǎng)的L-929小鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)浸提液處理后形態(tài)良好，增殖旺盛，材料毒性評

9、級為0～1；②無皮膚刺激反應(yīng)和過敏反應(yīng)，皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果PⅡ(原發(fā)性刺激指數(shù))為0.4，和陰性對照組無顯著性差別；③全身毒性試驗(yàn)結(jié)果受試動物未出現(xiàn)毒性癥狀；④溶血試驗(yàn)溶血率為0.7％，符合國家標(biāo)準(zhǔn)(<5％)；⑤熱原試驗(yàn)：3只家兔體溫升高均低于0.6℃/只，且升高總數(shù)低于1.4℃/3只。 結(jié)論：戊二醛固定的牛頸靜脈管道經(jīng)丹寧酸改性處理后，該材料的交聯(lián)程度及彈力纖維穩(wěn)定性提高，其血液相容性亦明顯改善。此外，經(jīng)此改性處理的牛頸靜脈材料

10、的生物相容性符合國家醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行下一步大動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 第三部分：羊右心室流出道重建模型評價(jià)管道血流動力學(xué)性能和組織學(xué)改變。 目的：此部分研究采用羊右心室流出道重建模型，從管道血流動力學(xué)表現(xiàn)和組織學(xué)改變等方面，評價(jià)丹寧酸改性處理對戊二醛固定的牛頸靜脈帶瓣管道的影響。 方法：新鮮牛頸靜脈帶瓣管道經(jīng)戊二醛或戊二醛/丹寧酸法固定后，植入羊右心室流出道(戊二醛組3例，戊二醛/丹寧酸組5例)，術(shù)中結(jié)扎羊自體主肺動脈

11、。管道定于術(shù)后6月和12月取出。觀察項(xiàng)目包括：(1)術(shù)中管道材料的手術(shù)操作性能；(2)手術(shù)結(jié)束時(shí)和取材時(shí)，行右心室-主肺動脈壓差峰值測量和超聲心動圖檢查；(3)取材后，肉眼和顯微鏡下觀察管道組織學(xué)改變，并定量分析組織鈣含量。 結(jié)果：戊二醛/丹寧酸組管道的手術(shù)可操作性強(qiáng)。術(shù)畢即刻，兩組管道的血流動力學(xué)表現(xiàn)相似。每組各1只動物術(shù)后短期死于肺部并發(fā)癥，其余動物均長期存活。術(shù)后6個(gè)月或12個(gè)月，戊二醛組動物的右心室-肺動脈最大壓差顯著升

12、高，超聲心動圖檢查顯示該組管道有明顯返流、呈輕-中度擴(kuò)張；此外，該組管道內(nèi)有血栓形成，組織學(xué)檢測顯示其管壁炎癥反應(yīng)、彈力纖維降解以及鈣化明顯。相反，在戊二醛/丹寧酸組，右心室-主肺動脈壓差峰值維持正常，未見管道返流或擴(kuò)張；而且，管道內(nèi)未見血栓形成，其管壁組織結(jié)構(gòu)保存完好，未見明顯的組織學(xué)異常改變。 結(jié)論：本研究初步顯示，丹寧酸改性處理不影響牛頸靜脈管道的手術(shù)操行性能。丹寧酸改性處理不僅減輕戊二醛固定的牛頸靜脈管道的血栓形成、炎癥