山茱萸不同栽培品種SCAR標(biāo)記的研究.pdf

1、中藥材山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)除去果核的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效，現(xiàn)代研究證明山茱萸具有較好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用和顯著的降血糖作用。因此，中醫(yī)臨床用量較大，同時(shí)作為常用中成藥(如六味地黃丸等)原料，中藥生產(chǎn)用量也很大。我國學(xué)者根據(jù)山茱萸不同栽培品種果實(shí)的形狀、大小、重量、顏色等對(duì)種內(nèi)性狀變異、類型劃分進(jìn)行了初步研究，分為橢圓形果型、長圓柱形果型、

2、圓柱形果型、短圓柱形果型、長梨形果型、短梨形果型。國內(nèi)外對(duì)山茱萸的研究主要集中對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用等方面的研究，但對(duì)種內(nèi)變異的物質(zhì)基礎(chǔ)——基因缺乏深入研究，不利于山茱萸種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)室已利用RAPD技術(shù)建立了山茱萸優(yōu)良品種的DNA遺傳圖譜。還獲得了山茱萸ITS完全序列。本實(shí)驗(yàn)將現(xiàn)有的RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記。通過對(duì)多態(tài)性RAPD產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)更長

3、的引物將RAPD-PCR轉(zhuǎn)變成為經(jīng)典的PCR。主要結(jié)果如下： 1.在實(shí)驗(yàn)室確定的改良的CTAB法的基礎(chǔ)上，對(duì)提取條件又進(jìn)行了改進(jìn)，確定了符合SCAR-PCR分析的總DNA的提取方法，該法從山茱萸葉片及果實(shí)中提取的總DNA雜質(zhì)少、質(zhì)量好，擴(kuò)增效果良好。 2.對(duì)山茱萸的七個(gè)栽培品種進(jìn)行RAPD分析，構(gòu)建了親緣關(guān)系樹系圖。 3.用上海生工S系列引物S37、S43、S92對(duì)山茱萸及其栽培品種進(jìn)行RAPD分析，從中篩選特異

4、性的條帶ST37、ST43、ST92進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序。用PrimetrPremier(v5.0)設(shè)計(jì)了8對(duì)SCAR特異性引物，經(jīng)過篩選得到結(jié)果的引物一共4對(duì)。用篩選出來的引物對(duì)山茱萸不同栽培品種及其同科植物、混偽品材料進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件得到幾條引物通用的PCR反應(yīng)體系： (1) 30μl反應(yīng)體系：其中10×PCR buffer。2.5μl，dNTP(2.5mM)3.0μl，Mg<'3>(25mM)3.0μl，引物

5、(10μM)各2.5μl，模板DNA(230μg/g～1499μg/g)6.0μl，Taq酶(5U/μl)1.5μl，去離子水9μl。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢用0.5μg/ml的EB染色，拍照。 (2)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性8min，變性94℃，1min；退火52℃(ST37A)或55℃(ST37B)或42℃(ST43)或60℃(ST92)，1min；延伸72℃，1.5 min；45個(gè)循

6、環(huán)(ST37A，ST37B，ST43)或40個(gè)循環(huán)(ST92)，72℃10 min補(bǔ)齊。 (3)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室確定的山茱萸ITS序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，使用的PCR反應(yīng)體系同上，循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性8min，變性94℃，1min；退火55℃，1min；延伸72℃，1.5 min；40個(gè)循環(huán)，72℃10min補(bǔ)齊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：根據(jù)特異性條帶ST37序列設(shè)計(jì)的SCAR引物ST37A對(duì)7個(gè)山茱萸品種及株木、四照花、葡萄、山楂樣本的D

7、NA進(jìn)行SCAR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)7個(gè)山茱萸品種均能產(chǎn)生單一的PCR產(chǎn)物，而且譜帶的大小與原始的RAPD標(biāo)記基本一致。其中兩個(gè)品種還產(chǎn)生了另一條特異性譜帶，可以做為這兩個(gè)品種的鑒別依據(jù)，并且膠圖清楚地顯示了山茱萸和梾木、四照花、葡萄、山楂產(chǎn)生的譜帶截然不同。根據(jù)特異性條帶ST37序列設(shè)計(jì)的另一對(duì)SCAR引物ST37B對(duì)7個(gè)山茱萸品種擴(kuò)增均能產(chǎn)生單一的PCR產(chǎn)物，但紡錘形果型樣本的譜帶大小比其余六個(gè)果型樣本的譜帶大小短了300bp左右，這條譜帶可

8、以做為紡錘形果型的鑒別依據(jù)。根據(jù)特異性條帶ST43序列設(shè)計(jì)的SCAR引物ST43對(duì)山茱萸7個(gè)果型擴(kuò)增產(chǎn)生單一的譜帶，而梾木、四照花、葡萄、山楂產(chǎn)生兩條譜帶，可以做為鑒別山茱萸的依據(jù)。根據(jù)特異性條帶ST92序列設(shè)計(jì)的SCAR引物ST92對(duì)圓柱形果型、長梨形果型兩個(gè)果型擴(kuò)增均產(chǎn)生了一條600～700bp的條帶，橢圓形果型、短圓柱形果型兩個(gè)果型產(chǎn)生了一條200～300bp的條帶，長圓柱形果型、紡錘形果型、短梨形果型三個(gè)果型無擴(kuò)增，說明ST92