薄荷醇通過TRPM8通道誘導人膀胱癌T24細胞株死亡的試驗研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性病變,居男性惡性腫瘤發(fā)病率第四位,死亡率第八位。盡管大部分新發(fā)患者可以通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(TUR-Bt)治療,但術后腫瘤復發(fā)率高,因此,如何降低患者術后腫瘤復發(fā)率是目前膀胱癌相關研究的焦點。目前研究已顯示術后膀胱灌注化療和免疫治療可以降低患者術后復發(fā)率,但現(xiàn)有藥物對術后腫瘤復發(fā)率緩解作用有限,且部分副作用難以耐受,需要進一步尋找安全高效的藥物來降低膀胱癌患者TUR-Bt術后復發(fā)的難題。
　　 薄荷醇是

2、從唇形科植物薄荷中提取的薄荷揮發(fā)油中主要成分,是一種已被應用了幾千年的植物藥,并被美國食品藥品管理局(FDA)視為安全無毒藥物,在醫(yī)藥食品等多領域廣泛應用。研究表明薄荷醇對前列腺癌、黑色素瘤、白血病、胃癌等癌細胞生長有抑制作用,但同時也有試驗提示薄荷醇可以促進神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細胞、神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞的分泌功能及遷徙能力,促進腫瘤的生長。而就其機制而言,研究已顯示薄荷醇不但能通過其特異性受體一瞬時受體電位通道M8(TRPM8,或稱為CMR1

3、或Trpp8)抑制腫瘤生長,尚可通過非TRPM8通道抑制腫瘤細胞的生長。因此,薄荷醇與惡性腫瘤之間的研究才拉開序幕。
　　 本課題擬分三部分來探討薄荷醇對膀胱癌增殖的影響及機制,以期為膀胱癌的臨床治療和薄荷醇的新藥開發(fā)奠定理論基礎。本課題的創(chuàng)新點:1)首次觀察了人膀胱癌細胞系T24細胞中TRPM8通道的表達和功能情況；2)首次觀察了薄荷醇對T24細胞增殖的影響；3)深入探討了薄荷醇調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的可能機制。
　　 第一

4、章 人膀胱癌T24細胞中TRPM8的表達及活性的研究
　　 目的:探討人膀胱癌T24細胞中是否存在TRPM8通道的表達及其亞細胞結構分布和功能
　　 方法:體外常規(guī)培養(yǎng)人膀胱癌T24細胞、HEK293細胞及HEK293-TRPM8細胞,使用Trizol法和RIPA法分別提取細胞總RNA和總蛋白,進一步使用聚合酶鏈式反應(PCR)和western蛋白印跡試驗(western blotting)分別檢測TRPM8基因的mRN

5、A和蛋白表達情況。并使用免疫熒光雜交檢測在共聚焦顯微鏡下觀察人膀胱癌T24細胞TRPM8蛋白的表達及分布。利用鈣成像技術檢測T24細胞中TRPM8通道在低溫刺激下對鈣離子(Ca2+)的調(diào)控功能。
　　 結論:人膀胱癌細胞系T24細胞表達具有活性功能的TRPM8通道,可以介導Ca2+通透,且TRPM8蛋白在T24細胞的細胞核外細胞器表達,分布于胞膜和胞漿。
　　 第二章 薄荷醇抑制人膀胱癌細胞株T24細胞增殖的研究

6、　　 目的:探討TRPM8通道及薄荷醇對人膀胱癌T24細胞增殖的影響
　　 方法:利用基因調(diào)控技術構建pcDNA3-TRPM8表達型質(zhì)粒和siRNA-TRPM8干擾單體,調(diào)控T24細胞中TRPM8的表達,并使用CCK-8檢測觀察,在TRPM8蛋白表達變化時,T24細胞的增殖情況。同時使用TRPM8通道的激活劑-薄荷醇干預,觀察T24細胞的增殖情況。進一步使用薄荷醇和siRNA-TRPM8單體共同干預T24細胞,CCK-8檢測觀

7、察T24細胞的增殖情況,以了解TRPM8通道的增殖活性。統(tǒng)計學數(shù)據(jù)均(x)±s表示,統(tǒng)計學采用單因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:對于人膀胱癌T24細胞,TRPM8蛋白的表達變化不影響其生長增殖,但TRPM8通道的激活劑一薄荷醇,可以呈劑量依賴性抑制T24細胞的生長,但該種效應需要TRPM8通道參與。
　　 第三章 薄荷醇抑制人膀胱癌T24細胞生長的機制的研究

8、>　　 目的:探討薄荷醇抑制人膀胱癌T24細胞生長的機制
　　 方法:利用流式細胞學細胞篩選法,分別使用PI單染和Annexin V-FITC/PI雙染觀察不同濃度薄荷醇干預下,T24細胞的各細胞周期細胞比例及凋亡和死亡細胞比例。進一步使用鈣成像技術,檢測不同濃度薄荷醇對T24細胞內(nèi)[Ca2+]i的影響。并使用JC-1熒光探針法和DCFH-DA熒光探針法在共聚焦顯微鏡下分別觀察不同濃度薄荷醇對T24細胞中線粒體膜電位和細胞內(nèi)活

9、性氧(ROS)的影響。再進一步使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和薄荷醇共同干預,CCK-8檢測觀察其對T24細胞增殖的影響。最后使用western蛋白印跡法檢測ROS生長相關通路信號蛋白的表達變化。統(tǒng)計學數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,統(tǒng)計學采用單因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:薄荷醇通過增加人膀胱癌T24細胞內(nèi)[Ca2+]i,導致線粒體去極化或非線粒體通路激活,而誘發(fā)細胞內(nèi)ROS