花生四烯酸(ARA)對(duì)草魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制分析.pdf

1、作為主要的n-6系列高不飽和脂肪酸(HUFA)，花生四烯酸(ARA;20:4n-6)是重要的活性分子類(lèi)二十烷酸的前體，其本身和代謝產(chǎn)物在調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝、生物學(xué)過(guò)程和免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用。過(guò)去ARA在魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)中的研究集中在其對(duì)生長(zhǎng)、成活率、抗應(yīng)激、免疫過(guò)程、繁殖性能、色素沉積和骨骼生成等方面的影響，很少關(guān)注其在脂質(zhì)蓄積調(diào)控中的作用，而在哺乳動(dòng)物中ARA及其代謝產(chǎn)物已被確認(rèn)能夠影響脂肪生成和其他脂代謝過(guò)程。養(yǎng)殖草魚(yú)易在腹腔蓄積過(guò)多

2、的脂肪，采用營(yíng)養(yǎng)學(xué)途徑調(diào)控魚(yú)類(lèi)的脂質(zhì)蓄積是水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要課題之一。因此，本論文開(kāi)展了五個(gè)試驗(yàn)，著重探討了ARA對(duì)草魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制，以期為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及功能性飼料開(kāi)發(fā)提供參考資料。
　　獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、日糧0.3％ ARA降低草魚(yú)體脂蓄積并提高魚(yú)體健康狀況。采用含不同水平ARA（0.00％、0.30％和0.60％）的三組等氮等能純化日糧飼喂草魚(yú)幼魚(yú)（6.87±1.18 g）60天。0.30％ARA組

3、的腹腔脂肪指數(shù)(IPFI)和全魚(yú)的脂質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組，且ARA組肝胰臟的脂質(zhì)含量明顯降低。在肝胰臟中和IPF組織中，過(guò)氧化物酶體增殖受體γ（PPARγ）和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA水平在ARA組顯著降低。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性在0.30％組最低，且顯著低于0.60％組。血清腫瘤壞死因子α(TNFα)和白介素6（IL-6）濃度隨著ARA含量的升高而下降。腎臟toll樣受體22(TLR22)和骨髓分化

4、因子88(MyD88)的mRNA水平在0.30％組最高，在對(duì)照組最低。結(jié)果表明適量的ARA(0.30％)能夠通過(guò)調(diào)整脂代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)抑制脂質(zhì)蓄積，通過(guò)降低血清轉(zhuǎn)氨酶活力和促炎因子的濃度以及提高腎臟免疫基因的表達(dá)提高草魚(yú)健康狀況。
　　2、環(huán)氧合酶(COX)途徑代謝產(chǎn)物參與草魚(yú)脂質(zhì)蓄積調(diào)控。設(shè)計(jì)了三組等氮等能純化日糧，即無(wú)ARA（對(duì)照），ARA(0.30％)，和ARA+ASA（乙酰水楊酸;COX抑制劑）日糧，飼喂草魚(yú)幼魚(yú)（27.

5、65±3.05 g）8周。ARA降低了肝胰臟的脂質(zhì)含量，而ASA顯著恢復(fù)肝胰臟的脂質(zhì)蓄積。ARA顯著降低了肝胰臟FAS和硬脂酰CoA去飽和酶(SCD)的基因表達(dá)，但是ASA沒(méi)有恢復(fù)這些基因的表達(dá)水平。有趣的是，ARA增加了PPARα的表達(dá)，并且ASA能夠減弱該基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明COX代謝產(chǎn)物在抑制草魚(yú)肝胰臟脂質(zhì)蓄積方面發(fā)揮重要的作用，并且該機(jī)制可能和其調(diào)控脂質(zhì)分解基因，而不是脂質(zhì)合成基因的表達(dá)有關(guān)。
　　3、ARA對(duì)草魚(yú)脂肪

6、生成具有雙重作用?；谏弦粋€(gè)試驗(yàn)的研究結(jié)果，采用三組等氮等能純化日糧，即無(wú)ARA、ARA和ARA+ASA日糧對(duì)試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行4周和8周飼喂并進(jìn)行采樣。結(jié)果顯示在第8周時(shí)，ARA處理組IPFI和脂肪細(xì)胞大小均顯著低于對(duì)照組，并且這種脂肪生成的抑制能夠被ASA恢復(fù)。而在第4周，IPFI和脂肪細(xì)胞大小在ARA組顯著升高，并且與ARA+ASA組無(wú)明顯差異。為進(jìn)一步探究ARA對(duì)草魚(yú)脂肪細(xì)胞分化的影響，將ARA與匯合時(shí)草魚(yú)前體脂肪細(xì)胞共孵育3天。發(fā)現(xiàn)A

7、RA以濃度依賴(lài)性的方式促進(jìn)脂肪生成。LOX和PPARγ抑制劑能夠減弱ARA的促分化功能。但是在處理8天后，ARA處理的脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量相比油酸(OA)處理的顯著下降，并且ASA能夠阻斷這一作用。結(jié)果表明ARA具有對(duì)草魚(yú)脂肪生成的雙重作用，LOX通路在ARA短期處理促進(jìn)脂肪生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而COX通路可能是ARA長(zhǎng)期處理脂肪細(xì)胞后抑制脂肪生成的關(guān)鍵。
　　4、長(zhǎng)期飼喂日糧0.3％ ARA降低草魚(yú)脂肪組織發(fā)育及炎癥反應(yīng)。采用

8、了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DNA甲基化組學(xué)整合分析飼喂ARA或無(wú)ARA(對(duì)照)日糧10周的草魚(yú)(10.21±0.10g)脂肪組織基因表達(dá)譜及甲基化狀態(tài)。RNA-seq結(jié)果顯示有611個(gè)基因顯著上調(diào)，973個(gè)基因顯著下調(diào)。日糧ARA對(duì)不同ARA代謝酶具有差異性調(diào)控作用，ARA降低了細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)了脂質(zhì)分解和膽汁酸合成相關(guān)基因;同時(shí)，ARA降低了炎癥相關(guān)趨化因子、脂肪因子以及相關(guān)受體的基因表達(dá)，降低了氧化應(yīng)激以及血管生成

9、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平等。通過(guò)整合分析轉(zhuǎn)錄組和差異DNA甲基化基因，獲得了153個(gè)交合基因，其中4個(gè)與ARA代謝相關(guān)，5個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)，4個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，11個(gè)與脂肪生成相關(guān)，2個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)和14個(gè)炎癥相關(guān)。以上結(jié)果為全面理解ARA對(duì)草魚(yú)脂肪組織在轉(zhuǎn)錄水平和表觀遺傳水平上的影響提供了參考資料。
　　5、同等濃度下日糧ARA在調(diào)控草魚(yú)脂質(zhì)蓄積作用上比二十碳五烯酸(EPA)更強(qiáng)。設(shè)計(jì)了4組等氮等能純化日糧，即對(duì)照組，0.30％AR

10、A組，0.30％EPA組和0.30％ARA+EPA（等量）組，飼喂草魚(yú)幼魚(yú)（10.21±0.10 g）10周。結(jié)果顯示ARA和EPA降低了肝胰臟甘油三酯(TG)水平，伴隨著肝胰臟LPL活性（ARA組）和HL活性(ARA和EPA組)的降低。轉(zhuǎn)錄水平，ARA和EPA降低了肝胰臟FAS，二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和載脂蛋白E(apoE)的基因表達(dá)，但僅ARA組增加了肝胰臟脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表達(dá)。ARA顯著降低了IPFI和腹

11、腔脂肪細(xì)胞大小，但是EPA沒(méi)有明顯的影響。同時(shí)，ARA降低了脂肪生成基因CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白(C/EBPα)、LPL和FAS的表達(dá)，增加了脂質(zhì)分解基因PPARα、ATGL、激素敏感性脂肪酶(HSL)和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)-1的表達(dá)，而EPA在調(diào)控這些基因方面作用較弱。表明ARA在調(diào)控草魚(yú)脂質(zhì)蓄積方面的能力更強(qiáng)，特別是在脂肪組織。
　　綜上所述，1）日糧ARA能夠有效降低草魚(yú)脂質(zhì)蓄積，其作用是通過(guò)抑制脂肪生成和促進(jìn)脂肪分

12、解實(shí)現(xiàn)的，其中COX介導(dǎo)的ARA代謝產(chǎn)物在調(diào)控脂質(zhì)分解能力方面發(fā)揮重要作用。2）ARA對(duì)草魚(yú)脂肪細(xì)胞發(fā)育具有時(shí)間相關(guān)的不同作用，在細(xì)胞分化初期LOX途徑在促進(jìn)脂肪生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而在分化末期COX途徑參與抑制脂質(zhì)蓄積。3）ARA在降低脂肪細(xì)胞發(fā)育的同時(shí)還降低了炎癥相關(guān)關(guān)鍵細(xì)胞因子和趨化因子基因的表達(dá)，且DNA甲基化在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。4）同等濃度下，日糧ARA在調(diào)控脂質(zhì)蓄積和脂代謝相關(guān)基因方面比EPA作用更強(qiáng)。以上結(jié)果為闡明