轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因水稻抗紋枯病和爛秧病研究.pdf

1、本研究為了獲得具廣譜和持久抗性的水稻新種質(zhì)，抵抗壞死營養(yǎng)型病原菌誘發(fā)的多種病害和生產(chǎn)過程中的多種逆境，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法首次將來源于昆蟲桿狀病毒的細(xì)胞凋亡抑制基因Op-iap和p35導(dǎo)入水稻中。 依目的基因編碼區(qū)序列設(shè)計了三對引物，從昆蟲表達(dá)載體pIE1-4opiap和pIE1-4p35中擴(kuò)增了細(xì)胞凋亡抑制基因iap和p35。Op-iap基因的編碼區(qū)長807bp，編碼一個由268個氨基酸組成的，分子量約為30kDa具有抑制細(xì)胞

2、凋亡功能的蛋白；p35基因長為900bp，編碼一個由299個氨基酸組成的，分子量約為35kDa的具有抑制細(xì)胞凋亡功能的蛋白。將兩個基因單獨(dú)及其組合分別插入pCAMBIA1301，構(gòu)建了三個植物表達(dá)載體p1301-iap、p1301-p35和p1301-iap-p35，經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定和核苷酸序列測定等分析確認(rèn)構(gòu)建無誤。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法通過構(gòu)建的載體將目的基因和對照(gus基因)導(dǎo)入粳稻品種“中花8號”、“中花10號”

3、和“Aichiasahi”，共獲得轉(zhuǎn)基因水稻485株。經(jīng)Southern-blot、Northern-blot和RT-PCR分析，導(dǎo)入的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，并轉(zhuǎn)錄了完整的mRNA。利用PCR擴(kuò)增結(jié)果對T1代的外源基因分離進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明：目的基因在T1代中符合孟德爾分離比例，并與選擇標(biāo)記基因緊密連鎖。 接種立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)并調(diào)查轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病級別，計算平均病級及病情指數(shù)。接

4、種20天時，提取病斑周圍組織的DNA，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察細(xì)胞凋亡的典型標(biāo)志DNA片段化。觀察、計算及統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，導(dǎo)入了細(xì)胞凋亡抑制基因的“中花8號”T0代植株能夠抑制壞死營養(yǎng)型病原真菌侵染誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，顯著地提高了受體品種對稻紋枯病的抗性。 轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因水稻的T1代幼苗能夠抑制在低溫、弱光、短日照等不良環(huán)境條件下由立枯絲核菌(Rhizoctonisolani)侵染誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，顯著地提高了秧苗的存活率和抗