Kif2a基因沉默抑制舌鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、口腔粘膜的鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，是全球十大高發(fā)癌癥之一。近年來(lái)，口腔癌的發(fā)病率有逐年增高和年輕化的趨勢(shì)。其中舌癌是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且惡性程度高，轉(zhuǎn)移率大，占人類(lèi)惡性腫瘤死亡率的1％左右，其治療后的5年生存率約為30％～50％。腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后不良的主要因素，因此對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究將會(huì)為腫瘤的治療及腫瘤患者預(yù)后的改善提供重要的線(xiàn)索。
　　 研究表明在影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移諸多因素中，細(xì)胞

2、骨架的改變?cè)谀[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中構(gòu)成細(xì)胞骨架主要成分之一的微管的減少及解聚與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。微管(MT)是細(xì)胞骨架的主要成分之一，構(gòu)成細(xì)胞的網(wǎng)狀支架，維持細(xì)胞形態(tài)；參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞的收縮與偽足運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞器的位移，尤其是染色體的分裂和位移，需要在微管的幫助下進(jìn)行。微管還與有絲分裂和減數(shù)分裂等生命活動(dòng)密切相關(guān)。大多數(shù)微管處于動(dòng)態(tài)的聚合和解聚及之間的隨機(jī)轉(zhuǎn)換狀態(tài)。在微管解聚和聚合過(guò)程中，驅(qū)動(dòng)蛋白發(fā)揮重要作用。驅(qū)

3、動(dòng)蛋白(Kinesin)是真核細(xì)胞中一類(lèi)保守的具有ATP酶活性的微管馬達(dá)蛋白。它們可利用水解ATP產(chǎn)生的能量沿微管運(yùn)動(dòng)，參與細(xì)胞內(nèi)多種重要的生命活動(dòng)，包括膜性細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、mRNA的運(yùn)輸?shù)取inesin-13是驅(qū)動(dòng)蛋白家族中的一類(lèi)特殊的蛋白質(zhì)，具有解聚微管的作用，在哺乳動(dòng)物中可以分為3個(gè)亞家族：Kif2a、Kif2b和Kif2c。研究顯示，Kif2a定位于中心體，因此可能參與中心體的移動(dòng)過(guò)程。Homma等采用啟動(dòng)子捕獲策略(prom

4、oter trap strategy)建立Kif2a敲除小鼠模型，通過(guò)遷移率統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組相比，Kif2a敲除組小鼠出現(xiàn)大腦神經(jīng)元遷移延遲、腦組織板層缺失及神經(jīng)核定位錯(cuò)誤等現(xiàn)象，提示Kif2a缺失可影響神經(jīng)元的遷移能力。由此可以推測(cè)Kif2a缺失可能通過(guò)改變神經(jīng)元胞體的微管動(dòng)力學(xué)，而最終導(dǎo)致了神經(jīng)元遷移缺陷。
　　 在細(xì)胞有絲分裂期，Kif2a主要定位于紡錘體極并參與細(xì)胞內(nèi)雙極紡錘體的組裝及姐妹染色體的分離；Neil.J

5、 Ganem、Zhu等采用RNAi技術(shù)分別沉默人U2OS細(xì)胞及HeLa細(xì)胞中的Kif2a基因，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂期單極紡錘體形成，從而證實(shí)Kif2a對(duì)細(xì)胞雙極紡錘體的形成是必需的。同樣，Jedidiah Gaetz等將Kif2a單克隆抗體加入蟾蜍卵細(xì)胞中，結(jié)果出現(xiàn)微管束延長(zhǎng)的單極紡錘體?；诖?，可以推測(cè)阻斷Kif2a的表達(dá)有助于阻止惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)紡錘體的正常形成，使染色體不能正常地分離，從而抑制增殖旺盛的惡性腫瘤細(xì)胞。
　　 鑒于

6、以往研究顯示的Kif2a在細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘體形成及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨架的改變中的重要作用，推測(cè)其在惡性腫瘤中可能存在異常表達(dá)并與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移存在相關(guān)性。而目前，關(guān)于Kif2a在惡性腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為了明確Kif2a在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平檢測(cè)舌鱗狀細(xì)胞癌組織中Kif2a的表達(dá)并探討其臨床意義。應(yīng)用針對(duì)Kif2a的siRNA質(zhì)粒沉默舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞中Kif

7、2a的表達(dá)，研究Kif2a基因?qū)?xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響。此外，還通過(guò)基因芯片技術(shù)研究了Kif2a基因沉默后Tca8113細(xì)胞全基因組表達(dá)譜的變化，從中找到差異顯著的基因并加以驗(yàn)證，分析Kif2a基因沉默抑制舌癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以探討其作為舌癌生物和基因治療潛在分子靶點(diǎn)的可能，為舌癌治療提供新的有效的治療策略。
　　 第一部分Kif2a在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義
　　 目的：研究微管解聚蛋白Kif2a在舌

8、鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本收集：收集2005～2008年山東大學(xué)口腔醫(yī)院44例舌鱗狀細(xì)胞癌住院患者的腫瘤標(biāo)本?；颊甙凑漳挲g、性別、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移分類(lèi)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《頭頸部腫瘤病理和遺傳學(xué)》(世界衛(wèi)生組織分類(lèi)及診斷標(biāo)準(zhǔn))。所有患者術(shù)前均未行放療、化療以及其它干預(yù)治療，并同期行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)。
　　 2.應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)Kif2a蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌、配

9、對(duì)癌旁組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)定位，并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分分析，評(píng)價(jià)Kif2a蛋白的表達(dá)與臨床資料之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，44例舌癌原發(fā)灶與配對(duì)癌旁組織均見(jiàn)Kif2a陽(yáng)性表達(dá)；其中與配對(duì)癌旁組織相比，70.5％(31/44)的舌癌原發(fā)灶高表達(dá)Kif2a。Kif2a蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及胞核，呈棕黃色顆粒，在舌癌細(xì)胞胞漿中染色較強(qiáng)、棕黃色顆粒較粗大，而在癌旁組織細(xì)胞中染色較弱、黃色顆粒??；與配對(duì)舌癌原發(fā)灶相

10、比，70％(14/20)淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞高表達(dá)Kif2a。Kif2a陽(yáng)性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)，呈深棕黃色、粗大顆粒。此外，Kif2a的表達(dá)在Ⅲ/Ⅳ期腫瘤細(xì)胞高于Ⅰ/Ⅱ期腫瘤細(xì)胞；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌細(xì)胞高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌細(xì)胞。Kif2a的表達(dá)與病人性別、年齡、腫瘤分級(jí)及組織學(xué)類(lèi)型均無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論：Kif2a在舌鱗狀細(xì)胞癌中的存在異常表達(dá)，在癌旁組織弱表達(dá)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于原發(fā)灶

11、癌細(xì)胞。Kif2a的表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kif2a可作為評(píng)價(jià)舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的一個(gè)重要因子。
　　 第二部分Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響
　　 目的：
　　 1.探討siRNA介導(dǎo)的Kif2a基因沉默對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響。
　　 2.觀察化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)與Kif2a基因沉默對(duì)Tca81

12、13細(xì)胞增殖的共同作用。
　　 3.觀察Kif2a基因沉默對(duì)裸鼠舌癌移植瘤生長(zhǎng)情況的影響。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞在37℃，5％CO2飽和濕度條件下，培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100IU青霉素、100g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。
　　 2.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a質(zhì)粒及pGPU6/GFP/Neo-NC質(zhì)粒的構(gòu)建：于文獻(xiàn)資料中檢索到Kif2a

13、的siRNA序列。靶序列為5‘-GGCAAAGAGAUUGACCUGG-3’將此片段設(shè)計(jì)為shRNA，并克隆入pGPU6/GFP/Neo載體(含有編碼綠色熒光蛋白GFP的基因)，命名為pGPU6/GFP/Neo-Kif2a。陰性對(duì)照靶序列為5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT3’，將此片段設(shè)計(jì)為shRNA，并克隆入pGPU6/GFP/Neo載體，命名為pGPU6/GFP/Neo-NC。siRNA質(zhì)粒構(gòu)建及重組質(zhì)粒序列測(cè)定由上海吉

14、瑪公司完成。
　　 3.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干擾效率的檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞以2×105數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70％左右，用脂質(zhì)體liPofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC及空脂質(zhì)體。
　　 轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-

15、PCR方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中Kif2a的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染后72h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中Kif2a的蛋白表達(dá)。分析三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組中Tca8113細(xì)胞Kif2a的基因、蛋白表達(dá)情況。評(píng)價(jià)pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干擾效率。
　　 4.重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞系的建立及其鑒定：經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC轉(zhuǎn)

16、染Tca8113細(xì)胞，經(jīng)G418穩(wěn)定篩選，建立穩(wěn)定敲除Kif2a基因的細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a的陽(yáng)性克隆命名為Kif2a干擾組(Tca8113-Kif2a)，轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-NC的陽(yáng)性克隆命名為NC對(duì)照組(Tca8113-NC)。采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光判定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)Weatern blot方法檢測(cè)上述各組細(xì)胞中Kif2a的表達(dá)情況，鑒定Kif2a穩(wěn)定敲除的細(xì)胞模型。
　　

17、5.MTT法檢測(cè)Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響：取指數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8113細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)9天，于第1、3、5、7、9天采用MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。
　　 6.MTT法檢測(cè)5-Fu與Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖活性的共同影響：取指數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8

18、113細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度5-Fu，培養(yǎng)4天后采用MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。
　　 7.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Kif2a基因沉默后 Tca8113細(xì)胞克隆形成能力：20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液與1.2％的低熔點(diǎn)瓊脂糖混合作底層瓊脂，各組1×105個(gè)細(xì)胞與0.6％的瓊脂糖混勻，注入鋪有1.2％瓊脂糖底層平皿中，形成雙瓊脂層。置入37℃5％CO2溫箱中培養(yǎng)14天，在倒置

19、顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。
　　 8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡率的影響：取各組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按2×105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至約80％，收集細(xì)胞，AnnexinV/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化。
　　 9.Transwell小室方法觀察Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲遷移能力的影響：取各組無(wú)血清Tca8113細(xì)胞懸液100μl(1×105個(gè)細(xì)胞)加

20、入小室的上室，下室加入600μ l含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)20h。光鏡下計(jì)數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。
　　 10.裸鼠背部舌癌腫瘤模型的建立及其生長(zhǎng)情況：調(diào)整各組細(xì)胞懸液濃度為2×106個(gè)/ml備用。4周齡的BALB/c nu/nu雄性裸鼠共15只，隨機(jī)分成干擾組(Tca8113-Kif2a)、陰性對(duì)照組(Tca8113-NC)、空白對(duì)照組(Tca113)3個(gè)組(每組5只)。乙醚吸入麻醉后，

21、將以上3組 Tca8113細(xì)胞懸液100μl分別注射于對(duì)應(yīng)3個(gè)組裸鼠的背部皮下。每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，每4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。接種35天后脫頸處死三組裸鼠，剝離腫瘤，測(cè)量瘤體積、稱(chēng)量瘤重。
　　 結(jié)果：
　　 1.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a能夠有效下調(diào)Kif2a的表達(dá)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，干擾組 Tca8113細(xì)胞Kif2a mRNA的表達(dá)均較陰性對(duì)照組下降90％，轉(zhuǎn)

22、染后72h，干擾組Tca8113細(xì)胞Kif2a蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)。
　　 2.pGPU6/GFP/Neo-NC及pGPU6/GFP/Neo-Kif2a中含有編碼綠色熒光蛋白GFP的基因，穩(wěn)篩成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察可發(fā)出綠色熒光。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組Tca8113-NC相比，Tca8113-Kif2a組細(xì)胞Kif2a的蛋白表達(dá)下調(diào)76.5％。
　　 3.應(yīng)用MTT法檢測(cè)Kif2a基因沉默后T

23、ca8113細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種板后第1、2天，三組Tca8113細(xì)胞的增殖活性未見(jiàn)明顯差異，第3天開(kāi)始，干擾組細(xì)胞的增殖活性與陰性對(duì)照組相比出現(xiàn)降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
　　 4.5-Fu作用4天后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Tca8113-Kif2a細(xì)胞增殖活性顯著下降，5-Fu的半數(shù)抑制率IC50顯著降低，Kif2a基因沉默能顯著增強(qiáng)5-Fu對(duì)Tca8113細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，增加Tc

24、a8113細(xì)胞對(duì)5-Fu的藥物敏感性。
　　 5.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組Tca8113-NC相比，Tca8113-Kif2a組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Tca8113-Kif2a細(xì)胞凋亡率為28.94％，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異。
　　 7.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比干擾組穿過(guò)濾膜的Tca8113細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯

25、差異。
　　 8.三組腫瘤細(xì)胞注射裸鼠背部皮下后，在局部形成水腫，4天后即可觸及腫瘤硬結(jié)。腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，開(kāi)始呈圓形或者橢圓形，后來(lái)可呈結(jié)節(jié)狀。空白組與陰性對(duì)照組腫瘤體積無(wú)明顯差異，但Tca8113-Kif2a組生長(zhǎng)相對(duì)較慢，12天后各組裸鼠移植瘤的體積出現(xiàn)差異，35天處死裸鼠，Tca8113-Kif2a腫瘤體積、重量均明顯小于Tca8113-NC組。
　　 結(jié)論：
　　 1.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a

26、能夠有效地抑制Tca8113細(xì)胞中Kif2a的表達(dá)，Kif2a基因沉默后Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力明顯降低；Kif2a基因沉默能夠抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。
　　 2.Kif2a基因沉默能顯著增加化療藥物5-Fu對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，提高Tca8113細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，為舌癌化療提供了新的思路。
　　 3.Kif2a是基因治療舌鱗狀細(xì)胞癌的理想靶基因。
　　 第三部分Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)

27、胞全基因組表達(dá)譜變化的影響
　　 目的：
　　 1.分析Kif2a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞全基因組表達(dá)譜變化的影響，篩選與Kif2a信號(hào)通路有關(guān)的差異基因，以便更好地認(rèn)識(shí)Kif2a信號(hào)通路的傳導(dǎo)過(guò)程及其在舌癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移調(diào)控中的作用機(jī)制。
　　 2.探討Kif2a基因作為靶基因抑制舌鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、基因芯片技術(shù)研究Kif2a基因沉默對(duì)

28、Tca8113細(xì)胞全基因組表達(dá)譜變化的影響：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞5×106個(gè)，加Trizol提取總RNA，進(jìn)行基因芯片分析(上?？党缮镉邢薰?。使用GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度。采用LuxScan3.0圖像分析軟件(CaPitalBio公司)對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析處理，熒光染料cy3的信號(hào)用綠色表示，cy5的信號(hào)用紅色表示。整合兩張芯片熒光強(qiáng)度的比值，即Ratio值，以整合后的Ratio值≥12.0或≤0.5為

29、標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)基因，其中Ratio值≥12表示基因表達(dá)上調(diào)，Ratio值≤0.5表示基因表達(dá)下調(diào)。
　　 2.差異表達(dá)基因的通路分析及差異表達(dá)基因的驗(yàn)證：利用Biorag數(shù)據(jù)庫(kù)基因通路分析工具，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)技術(shù)對(duì)其中幾個(gè)重要的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)看家基因歸一化后，將通過(guò)real time RT-PCR檢測(cè)得到的差異表達(dá)基因的Ratio值與芯片檢測(cè)得

30、到的Ratio值進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因芯片掃描結(jié)果顯示信號(hào)清晰，富有層次，且背景均勻：黃色為T(mén)ca8113-Kif2a和Tca8113-NC兩種細(xì)胞共同表達(dá)的基因，紅色為T(mén)ca8113-Kif2a細(xì)胞過(guò)表達(dá)的基因，綠色為T(mén)ca8113-NC細(xì)胞過(guò)表達(dá)的基因，重復(fù)實(shí)驗(yàn)效果良好。
　　 2.基因表達(dá)譜分析比較，Tca8113-Kif2a與 Tca8113-NC之間共有2

31、093個(gè)存在顯著差異表達(dá)的基因。其中在干擾組明顯上調(diào)的基因主要包括細(xì)胞因子/趨化因子及其受體類(lèi)9個(gè)，細(xì)胞骨架/ECM調(diào)節(jié)因子類(lèi)9個(gè)，脂質(zhì)代謝類(lèi)類(lèi)5個(gè)，細(xì)胞表面分子/受體類(lèi)3個(gè)，轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)10個(gè)及其他類(lèi)12個(gè)；明顯下調(diào)的基因主要包括細(xì)胞因子/趨化因子及其受體類(lèi)2個(gè)，細(xì)胞骨架/ECM調(diào)節(jié)因子類(lèi)4個(gè)，脂質(zhì)代謝類(lèi)類(lèi)2個(gè)，細(xì)胞表面分子/受體類(lèi)4個(gè)，轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)3個(gè)及其他類(lèi)3個(gè)。
　　 3.差異表達(dá)基因的通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)的基因涉及多個(gè)

32、通路，主要包括細(xì)胞周期/有絲分裂、細(xì)胞凋亡以及PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 4.Real time RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，PI3K、Akt、Bcl-2，Bax和MMP-9基因的Ratio值與芯片檢測(cè)得到的Ratio值接近，證實(shí)本研究中基因芯片檢測(cè)得到的結(jié)果能較好地反映基因差異表達(dá)的趨勢(shì)，結(jié)果較可靠。
　　 結(jié)論：
　　 1.Kif2a基因沉默可導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞全基因組中部分基因的變化，并涉及多個(gè)