殼聚糖納米粒子介導Ⅲ型NaPi共轉運子基因轉染實驗的相關性研究.pdf

1、繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進(SecondaryhyperparathyroidismSHPT)是慢性腎功能衰竭(chronicalrenalfailureCRF)的重要并發(fā)癥，高磷血癥是刺激CRF患者甲狀旁腺素(parathyroidhormone，PTH)分泌的重要因素，但其分子發(fā)病機制尚不清楚?，F(xiàn)已證實PTH是尿毒癥患者體內重要的毒素之一，且用常規(guī)的透析方法不能清除，它在體內的蓄積可引起一系列遠期并發(fā)癥，如腎性骨病、骨髓纖維化、頑固性心

2、力衰竭及心律失常，動脈血管壁纖維化、鈣化，血管舒縮功能障礙，表現(xiàn)為難以糾正地嚴重高血壓和低血壓；體內免疫系統(tǒng)功能紊亂，患者易發(fā)生反復、多部位難以控制的感染及運動和植物神經的功能異常等，這些并發(fā)癥已逐漸成為影響患者生活質量及生存時間的重要原因。由于這些并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率高，對發(fā)病機制的了解及尋找有效地治療對策就倍受國內外學者的重視，是目前研究的熱點之一。 1937年TrumanG.Drake等學者對兔的實驗研究證實了磷是導致腎

3、功能不全甲狀旁腺細胞增殖(hyperplasia)的原因之一的假設。以后許多研究顯示在腎功能衰竭繼發(fā)甲狀旁腺機能亢進的發(fā)生發(fā)展中細胞外磷的濃度起了重要調節(jié)作用，但對高磷如何引起SHPT的作用機制的研究目前尚不夠十分深入。有研究證明當CRF早期(氮質血癥期)由于體內低鈣、高磷及酸堿代謝紊亂，其甲狀旁腺PTH分泌功能既行增加，而致終末期腎功能衰竭時幾乎100％的患者存在SHPT現(xiàn)象，此時血清PTH水平即不斷升高。 臨床及動物研究證明

4、：磷對PTH的影響是獨立于血清鈣和1.25(OH)2D3的因素，磷是PTH分泌增加的重要刺激因子。給正常個體口服高磷(1g)制劑，可導致血磷增加、血離子鈣下降和血PTH的水平上升，持續(xù)高磷飲食可導致腎小球率過濾下降和腎功能惡化，且當GFR下降到25ml/min時，大部分患者均出現(xiàn)明顯的高磷血癥；實驗大鼠腎功能不全6個月后既存在明顯的SHPT，此時將飲食中的含磷量每兩周減少一次，從0.9％降至0.3％(同時飲食中含鈣量從1.6％降至0.6

5、％，以防止高鈣血癥)，此時血清1.25(OH)2D3水平無明顯變化，血PTH水平卻顯著降低，但對血清鈣和1.25(OH)2D3水平影響不大。 基礎研究發(fā)現(xiàn)：高磷血癥可刺激甲狀旁腺細胞組織增殖，PTH分泌增加。正常生理狀態(tài)下甲狀旁腺細胞分裂較少，大部分維持在G0期，但尿毒癥時高磷、低鈣是細胞有絲分裂的潛在刺激物。在甲狀旁腺增殖中原癌基因c-fos,c-jun等表達水平明顯升高。此外，在進行尿毒癥血清刺激大鼠腎臟細膜細胞增殖的研究中

6、觀察到，PTH與腎功能進一步惡化，慢性腎臟疾病病變的進展明顯相關。尿毒癥患者由于磷的排泄減少，可進一步加重高磷血癥的發(fā)生，引起一系列的臨床并發(fā)癥。 新近發(fā)現(xiàn)的鈉磷共轉運子(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)是負責細胞攝取細胞外磷的跨膜蛋白，生理狀況下，其轉運活性與磷、PTH調控關系密切，其中NaPi-Ⅰ最初從非洲蟾蜍屬的卵母細胞上獲得負責轉運磷的表達活性；NaPi-Ⅱ是腎近端小管完成重吸收磷的主要轉運子，而NaPi-Ⅲ(pit-1)存在于人和大鼠甲

7、狀旁腺細胞膜上，參與對磷的攝取。但在SHPT病理狀態(tài)下，NaPi-Ⅲ對甲狀旁腺細胞內PTH及磷調控變化的研究至今未見報道。 本研究采用小分子RNA干擾技術(RNAi)抑制NaPi-Ⅲ轉運子的表達，殼聚糖納米粒作為RNA基因導入載體介導NaPi-ⅢsiRNA轉染HEK293細胞。殼聚糖是具有生物相容性和可生物降解的新型醫(yī)用生物材料，具有無刺激、無致敏、無溶血、無致突變、無抗原性、無熱原等作用已為實踐所證明，殼聚糖及其衍生物能與RN

8、A形成聚電解質聚合物，將是一種具有持久安全性和高效的陽離子聚合物基因轉移運輸載體。殼聚糖與磁性納米載體等其他納米載體相比較具有很好的生物相容性、可被體內多種酶類降解、降解產物安全無毒，并能被生物體完全吸收；對于基因治療，納米粒還有其他優(yōu)點，納米粒不僅包含穩(wěn)定的基因片段，防止基因的不穩(wěn)定性，還能夠同時包合某些導靶片斷及其他輔助成分，提高靶向性，提高基因進入細胞內的穿透性或者提高由于刺激受體產生的細胞內吞作用等，更有利于抑制NaPi-Ⅲ的表

9、達，從而提高治療慢性腎衰繼發(fā)性甲旁亢的療效。 本研究由四部分組成： 一、高磷飲食+5/6腎切除制備慢性腎衰竭繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進大鼠模型目的構建慢性腎衰竭繼發(fā)甲狀旁腺機能亢進大鼠模型，為研究腎性甲旁亢的發(fā)病機制及治療奠定基礎。方法選取36只8～10周齡SD大鼠，體重在200～250g。隨機分為6組，每組6只：5/6腎切除高磷飼料組(STNx+HP)；5/6腎切除低磷飼料組(STNx+LP)；5/6腎切除正常磷飼料組(ST

10、Nx+NP)；假手術高磷飼料組(Sham+HP)；假手術低磷飼料組(Sham+LP)；假手術正常磷飼料組(Sham+NP)。造模組予大鼠高磷飲食同時行大鼠5/6腎切除，大鼠手術前一周及手術后7d、14d、21d分別在大鼠眼內眥靜脈取血，分別檢測大鼠血清中離子鈣(iCa)，血磷(Pi)，全段甲狀旁腺索(iPTH)，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，尿磷酸鹽排泄分數(FEp)。術后4w取大鼠殘余腎臟及甲狀腺與甲狀旁腺的復合體，進行病理組織

11、學檢查。 二、人和大鼠的甲狀旁腺原代細胞培養(yǎng) 目的培養(yǎng)人和大鼠的甲狀旁腺細胞。方法甲狀旁腺組織取于慢性腎衰竭繼發(fā)甲旁亢內科治療無效而行外科甲狀旁腺部分切除術的患者，以及造模成功的腎性甲旁亢的大鼠，參考Leboff試驗和方法進行甲狀旁腺細胞原代培養(yǎng)。 殼聚糖納米粒子介導Ⅲ型NaPi共轉運子瞬時轉染人胚腎細胞HEK293 目的殼聚糖納米粒子介導Ⅲ型NaPi共轉運子瞬時轉染人胚腎細胞HEK293，觀察殼聚糖納米

12、粒子對人胚腎細胞HEK293的轉染效率。方法按照Lipofectamine2000(Invitrogen)操作說明將NaPi-ⅢsiRNA以及將NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒分別轉染人胚腎細胞HEK293細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效率。Westernblot檢測轉染后NaPi-Ⅲ蛋白含量，ELISA檢測NaPi-Ⅲ蛋白的表達水平。結果經熒光素標記的NaPi-ⅢsiRNA被轉入細胞后，細胞在熒光顯微鏡下發(fā)較亮的綠色熒光，發(fā)光點數目較少，

13、而NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉入細胞后，細胞在熒光顯微鏡下發(fā)較亮的綠色熒光發(fā)光點數目較多(見圖4-2、4-3)。根據轉染率=相對轉染率/標記效率可知，NaPi-ⅢsiRNA轉染率為41.9％，NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉染率為58.3％。westernBlotting檢測NaPi-ⅢsiRNA和NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉染人胚腎細胞HEK293細胞后，NaPi-ⅢsiRNA殼聚糖納米粒轉染人胚腎細胞HEK293