青霉素擴環(huán)酶基因克隆及在大腸桿菌中的高效表達研究.pdf

1、目的：頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)自從1948年被Brotsu發(fā)現(xiàn)，以及從禮萊公司在1964年上市第一個頭孢菌素頭孢噻吩以來，頭孢菌素作為一類廣譜半合成抗生素，至今已有60多個上市品種，并已從第一代發(fā)展到第四代。頭孢菌素和青霉素都具有β-內(nèi)酰胺特征，不同的是青霉素母核是由β-內(nèi)酰胺環(huán)和五元噻唑環(huán)構(gòu)成，而頭孢菌素母核則是由β-內(nèi)酰胺環(huán)和六元二氫噻嗪環(huán)構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)上的差異，使它能抗拒β-內(nèi)酰氨酶(如金黃色葡萄球菌S

2、taphylococcus aureus的β-內(nèi)酰氨酶，但不包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。)的降解。而且頭孢菌素具有高效、低毒、抗菌譜廣、過敏反應少、可以口服、品種多等優(yōu)點。 頭孢菌素作為一類廣譜半合成抗生素，它可以分為以7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)為母核和以7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)為母核的兩大系列。以7-ADCA為母核系列是青霉素的深加工產(chǎn)品，利用7-ADCA可以合成頭孢羥氨、頭孢拉定、頭孢克羅、頭孢他美酯

3、等頭孢菌素類抗生素藥物。由于這些頭孢菌素類抗生素可以口服且療效良好，使人們不斷尋找成功制備這些頭孢類抗生素的關(guān)鍵中間體7-ADCA經(jīng)濟有效的方法。 當前通過青霉素工業(yè)鹽擴環(huán)得到7-ADCA的主要方式是采用化學法擴環(huán)。但化學擴環(huán)反應要求有對羥基的“保護”和“去保護”過程等多步反應，步驟繁瑣，自動化水平低，且反應過程中不可避免的有開環(huán)副反應，影響產(chǎn)品收率和質(zhì)量?；瘜W法反應條件苛刻，使用大量的有機溶劑(如吡碇)，對環(huán)境造成污染。由于化

4、學法的弊端，使人們在清楚了頭孢菌素的生物合成途徑后積極尋找適當?shù)纳锕こ掏緩竭M行擴環(huán)。因此，青霉素擴環(huán)酶成為當今工業(yè)酶研究中的一大熱點。自1976年Kohsaka首先對低等真核生物頂頭孢菌的擴環(huán)酶進行研究，至今擴環(huán)酶的研究得到迅速發(fā)展。以棒狀鏈霉菌為來源的擴環(huán)酶由于具有潛在的工業(yè)應用價值而得到研究者的極大關(guān)注。在九十年代以前，只發(fā)現(xiàn)其以青霉素N作為底物的擴環(huán)活性。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)擴環(huán)酶對青霉素G有很弱的擴環(huán)活性。青霉素G作為一種

5、生物發(fā)酵最終產(chǎn)物，可以方便、廉價地獲得，所以擴環(huán)酶是否能有效地以青霉素G作為底物擴環(huán)產(chǎn)生頭孢菌素半合成重要中間體7-ADCA，并進行工業(yè)化生產(chǎn)成為人們研究的焦點。 本研究的目的：1．克隆棒狀鏈霉菌的擴環(huán)酶基因，構(gòu)建高表達的原核載體。2．在原核細胞中表達擴環(huán)酶，建立擴環(huán)酶的高效表達平臺。3．以青霉素G為底物建立擴環(huán)酶活性檢測體系。4．進行擴環(huán)酶結(jié)構(gòu)的改造，探索其工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。 方法 1．擴環(huán)酶基因克隆及原核表

6、達工程菌的構(gòu)建以從Streptomyces clavuligerus(ATCC-27064購自美國典型菌種培養(yǎng)物保藏中心)抽提得到的基因組DNA為模板，利用PCR方法擴增得到擴環(huán)酶基因片段。將獲得的PCR片段連接到pGEM-T easy載體中獲得插入擴環(huán)酶基因的質(zhì)粒pGEM-T easy/cefE。由于擴環(huán)酶的底物是β-內(nèi)酰胺類物質(zhì)，為了避免將來在擴環(huán)酶表達產(chǎn)物中含有β-內(nèi)酰胺類物質(zhì)，將質(zhì)粒pET-3b中Ampicillin抗性基因替換

7、成kanamycin抗性基因。 用NdeI和BamHI酶切質(zhì)粒pGEM-T easy/cefE，將得到cefE片段連接到已經(jīng)用NdeI和BamHI酶切處理的原核表達載體pET3b/Kan中。 將經(jīng)過酶切鑒定，確認構(gòu)建正確的pET3bKan/cefE原核表達載體通過CaCl<,2>法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)、BL(DE3)RP、BL21(DE3)RIL，鑒定后獲得重組的擴環(huán)酶原核表達菌株。 2.擴環(huán)酶

8、基因的表達純化以及活性的檢測用IPTG誘導表達后，收集菌體超聲裂解破碎細胞，使之釋放出可溶性的擴環(huán)酶蛋白，并離心獲上清液，將得到的上清液作為粗酶反應液進行活性檢測。 在反應體系中按照順序分別加入擴環(huán)酶擴環(huán)活性所必需的各種反應輔助因子，以及底物penicillin G，最后加入粗酶蛋白提取液。反應溫度為36℃，在搖床中220轉(zhuǎn)每分鐘反應1小時，然后加入等體積甲醇終止反應。 通過HPLC方法以合成的苯乙酸-7-ADCA(G-

9、7-ADCA、)為標準品并繪制標準曲線，進行定量檢測擴環(huán)反應后的產(chǎn)物G-7-ADCA。 3.擴環(huán)酶基因的改造由于擴環(huán)酶與青霉素生物合成過程中的異青霉素N環(huán)化酶(IPNS)結(jié)構(gòu)具有一致性，其C端氨基酸形成的空間結(jié)構(gòu)對與底物的親和性有很大影響，于是設(shè)計了五種不同的方案對擴環(huán)酶蛋白進行改造。并將改造后的擴環(huán)酶分別稱為GQY，GTY，RL，ARL，N-L。利用錯誤傾向性PCR和DNA shuffling對擴環(huán)酶進行體外定向進化，以篩選對

10、青霉素G底物高親和性和熱穩(wěn)定性佳的擴環(huán)酶，探索擴環(huán)酶工業(yè)化應用的可能性。 結(jié)果 1．擴環(huán)酶基因克隆及原核表達工程菌的構(gòu)建通過PCR擴增的方法，從棒狀鏈霉菌中獲得了野生型的擴環(huán)酶基因，并測定了其核酸序列，完成了擴環(huán)酶的原核表達質(zhì)粒pET3bKan/cefE的構(gòu)建。 2．擴環(huán)酶基因的表達以及活性的檢測將鑒定得到帶有擴環(huán)酶基因的表達質(zhì)粒的不同大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)，BL(DE3)RP、BL21(DE3)RI

11、L各挑選單克隆，選用2×YT、LB兩種培養(yǎng)基進行發(fā)酵研究，經(jīng)IPTG誘導，誘導產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE還原電泳，銀染觀察分析。篩選得到擴環(huán)酶蛋白的表達菌株。 為了表達后酶活性檢測分析，有利于酶蛋白的釋放和純化，優(yōu)化發(fā)酵條件，將培養(yǎng)基確定為豐富培養(yǎng)基2xYT，菌種培育溫度由37℃改為33℃，并降低誘導溫度，由37℃變?yōu)?8℃。使之由包涵體的表達形式改為可溶性的表達形式。經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化后，目標蛋白的表達量一般能穩(wěn)定的占到菌體總蛋白

12、量的30-50％，最高能達到60-70％。 在最初的Tris緩沖體系中，擴環(huán)酶對青霉素G的轉(zhuǎn)化率小于1％，經(jīng)過擴環(huán)酶反應體系優(yōu)化實驗，發(fā)現(xiàn)改變酶反應的緩沖體系，如改用MOPS、HEPES等生物緩沖體系能夠提高擴環(huán)酶對青霉素G的轉(zhuǎn)化效率。而且在使用細胞抽提物，以青霉素G作為底物進行擴環(huán)反應時，ATP、MgSO<,4>和KCl等并無重要的作用，最終確定了一個優(yōu)化后的反應體系。反應完成后采用HPLC方法進行反應產(chǎn)物的檢測，并以標準的G

13、-7-ADCA為標準品進行定量檢測反應產(chǎn)物G-7-ADCA。結(jié)果顯示采用優(yōu)化后的擴環(huán)反應體系，擴環(huán)酶對青霉素G的擴環(huán)轉(zhuǎn)化效率能達到10％以上。 3．擴環(huán)酶基因的改造經(jīng)過對改造后的五種酶蛋白的擴環(huán)活性測定分析，發(fā)現(xiàn)其中的RL和野生型擴環(huán)酶在同樣實驗操作下，其活性要高，對青霉素G的轉(zhuǎn)化效率能夠達到15％。 利用錯誤傾向性PCR和DNA shuffling相結(jié)合的方法構(gòu)建了擴環(huán)酶大腸桿菌表達文庫，以期望能篩選得到對底物青霉素G高親和性

14、的擴環(huán)酶，使其能適用于工業(yè)化的酶工程中。 結(jié)論 1．本實驗以棒狀鏈霉菌擴環(huán)酶為研究對象，通過PCR克隆得到野生型的擴環(huán)酶基因。 2．構(gòu)建了可溶性高表達擴環(huán)酶的基因工程菌株，建立了擴環(huán)酶在大腸桿菌中高效表達的平臺。 3．優(yōu)化以及簡化擴環(huán)酶的反應體系，獲得良好的實驗結(jié)果。 4．設(shè)計了五種經(jīng)過人工改造的擴環(huán)酶，并獲得擴環(huán)效率更高的突變體RL。 5．利用蛋白質(zhì)的定向進化方法錯誤傾向PCR和DNA