肝膽濕熱動(dòng)物模型的建立和龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的機(jī)理研究.pdf

1、肝膽濕熱動(dòng)物模型的建立和龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的機(jī)理研究肝膽濕熱為中醫(yī)常見(jiàn)證候之一，為濕熱蘊(yùn)結(jié)肝膽，使肝膽疏泄失常所致，所涉及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病種大多數(shù)是肝膽系疾病，臨床上主要表現(xiàn)身目黃疸，脅肋痛。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，身目黃疸是由于膽汁淤積所致。肝內(nèi)膽汁淤積(intra-haptic cholistasis，IC)是許多肝病共有的基礎(chǔ)病變。雖然傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)沒(méi)有肝內(nèi)膽汁淤積與之相應(yīng)的明確病名，但根據(jù)其臨床癥狀和體征，應(yīng)當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)“黃疸”、“

2、積聚”、“臌脹”等病范疇。濕、熱、瘀為其基本病因病機(jī)，為肝膽疏泄失常所致。 合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)理、藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及其作用機(jī)理研究的重要工具。然而，由于目前缺乏理想的肝膽濕熱動(dòng)物模型，使得有關(guān)肝膽濕熱的病因病機(jī)研究以及治療肝膽濕熱藥物的篩選、效果評(píng)價(jià)以及作用機(jī)理研究具有很大的困難。中醫(yī)臨床肝膽濕熱常有身目黃疸的客觀表現(xiàn)，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，身目黃疸是由于膽汁淤積所致。因此肝膽濕熱與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的膽汁淤積有相似之處，

3、故以誘導(dǎo)膽汁淤積的發(fā)生作為建立肝膽濕熱模型具有可能性。肝細(xì)胞和膽小管細(xì)胞膜上具有膽汁成分轉(zhuǎn)運(yùn)分子，它們與膽汁的形成和分泌有關(guān)。各種淤膽性肝損害時(shí)，肝細(xì)胞膜竇面或膽管面轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白分子的表達(dá)或功能將會(huì)受到不同的影響，多藥耐藥蛋白(MDR)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)是兩類與膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)的蛋白。近年來(lái)的研究表明，MDR或MRP基因缺陷可能與某些淤膽形成有關(guān)。 α-萘異硫氰酸酯(ANIT)在動(dòng)物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為有肝毒性的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生

4、肝毒性，其誘發(fā)動(dòng)物肝損傷的生物化學(xué)和病理形態(tài)學(xué)改變與人類肝內(nèi)膽汁淤積病變相似。 龍膽瀉肝丸(LD)由龍膽、柴胡、黃芩、梔子、澤瀉、木通、車(chē)前子、當(dāng)歸、地黃、炙甘草組成。具有清肝膽，利濕熱的功用，是臨床治療肝膽濕熱證的代表方之一。長(zhǎng)期以來(lái)，其在臨床上治療肝膽濕熱的效果得到公認(rèn)，但是，對(duì)其作用機(jī)理未見(jiàn)深入的研究，因此，其治療肝膽濕熱的作用機(jī)理尚不清楚。本研究將根據(jù)中醫(yī)臨床肝膽濕熱的主要客觀表現(xiàn)，參考現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的膽汁淤積的形成機(jī)理，建立

5、模擬肝膽濕熱的動(dòng)物模型，并對(duì)該模型的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探討。在該模型的基礎(chǔ)上研究龍膽瀉肝丸的治療肝膽濕熱的作用及其機(jī)理。 目的：首先采用ANIT建立模擬中醫(yī)臨床的肝膽濕熱模型，探討該模型在膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)代謝方面的分子機(jī)制。以該模型為基礎(chǔ)，觀察龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的作用機(jī)理，探討作用靶點(diǎn)，從而為龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一、大鼠肝膽濕熱模型的建立將10只大鼠分為對(duì)照組和模型組，每組5只。模型組按100

6、mg/kg的劑量一次性灌胃給予α-萘異硫氰酸酯(ANIT)花生油，對(duì)照組灌胃同體積花生油。造模后72h，大鼠——行膽管插管術(shù)。收集4 h內(nèi)的膽汁，按照收集的時(shí)間段計(jì)算膽汁分泌量。造模后76h檢測(cè)血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(CHO)水平以及肝組織病理變化。此外，將另外5只大鼠分別于灌胃ANIT后12h、24h、48h、72h、9

7、6h分別處死一只。另取1只作為正常對(duì)照。分別于不同時(shí)間點(diǎn)，取出肝臟，提取肝組織總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)MDRlb及MRP2 mRNA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二、觀察龍膽瀉肝丸(LD)對(duì)肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用將72只大鼠分為6組，分別為對(duì)照組，模型組，膽樂(lè)膠囊(DL)組和LD 10、5.0、2.5 g生藥/kg劑量組。LD各劑量組和DL組每日給藥1次，連續(xù)給藥8天。對(duì)照組灌胃同體積花生油。于給藥期間的第5天，除了對(duì)照組

8、外，其余各組在給藥后間隔1 h再灌胃給予ANIT 100 mg/kg(僅一次)。于第8天末次給藥后30 min(末次給藥前禁食24 h，不禁水)，行膽管插管，收集4 h內(nèi)的膽汁，按照收集的時(shí)間段計(jì)算膽汁分泌量。并檢測(cè)血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、CHO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平以及肝組織病理變化。另外72只小鼠按同樣方法復(fù)制模型，最后檢測(cè)血清TBIL、DBIL水平。實(shí)驗(yàn)三、觀察

9、龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠MDRla、MDRlb、MDR2、MRP1、MRP2表達(dá)的影響將20只大鼠分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg劑量組。給藥組均于動(dòng)物處死前8天開(kāi)始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對(duì)照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對(duì)照組給予花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天取出肝臟。提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)MDRla、MDRlb

10、、MDR2、MRP1、MRP2 mRNA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)四、觀察龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)的影響將20只大鼠分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg。給藥組均于動(dòng)物處死前8天開(kāi)始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對(duì)照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對(duì)照組花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天眼眶靜脈取100μl抗凝血，加入PE

11、標(biāo)記的CD18抗體，流式細(xì)胞儀測(cè)中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)，另取血20μl血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)白細(xì)胞及粒細(xì)胞總數(shù)。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一：大鼠肝膽濕熱模型的建立結(jié)果顯示，模型組給予ANIT 72h后，大鼠膽汁分泌量在膽管插管后4h內(nèi)一直顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，而血清TBIL、DBIL、CHO、ALT、AST、ALP水平明顯高于對(duì)照組。組織形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)模型組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和膽管損傷。對(duì)照組大鼠MDRlb mRNA無(wú)

12、明顯表達(dá)，MRP2 mRNA只有較弱表達(dá)。模型組大鼠在造模后48h～96h， MDRlb mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，但在造模后24h內(nèi)表達(dá)不明顯。造模后12h、24h，MRP2 mRNA表達(dá)較弱，而在造模后48h～96h均表達(dá)明顯。 實(shí)驗(yàn)二：龍膽瀉肝丸(LD)對(duì)肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用1.膽汁分泌結(jié)果顯示，模型組的膽汁分泌量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。LD各給藥組膽汁分泌量不同程度地高于模型組。LD 5.0g生藥/

13、kg組、LD2.5g生藥/kg組在1h和1.5h時(shí)間點(diǎn)的膽汁排泌量較模型組顯著增高(P<0.05)，其它時(shí)間點(diǎn)也有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.血清TBIL、DBIL、CHO水平模型組大鼠血清TBIL、DBIL、CHO水平均上升，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.01)。而LD 5.0g生藥/kg組、 LD2.5g生藥/kg組血清TBIL、DBIL、CHO與模型組比較有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.血清ALT、AST、

14、ALP模型組大鼠血清ALT、AST、ALP升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.01)。LD各劑量組的血清ALT、AST、ALP水平均與模型組比較無(wú)差異。 4.血清MDA、SOD、GSt{水平模型組大鼠血清MDA水平升高(與對(duì)照組比較P<0.01)，血清SOD及GSH水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。LD各劑量組血清SOD、GSH水平與模型組比較無(wú)明顯差異。LD對(duì)血清MDA有降低趨勢(shì)(與對(duì)照組比較P>0.05)。 5.肝臟組織

15、形態(tài)學(xué)各給藥組肝細(xì)胞壞死不同程度的輕于模型組，其中LD 2.5g生藥/kg組分別與模型組相比差異顯著(P<0.01)。 實(shí)驗(yàn)三：龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠MDRla、MDRlb、MDR2、MRP1、MRP2表達(dá)的影響1.肝組織MDRla、MDRlb、MDR 2 mRNA表達(dá)模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，肝組織MDRla、MDRlb mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。MDR2 mRNA也增加，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對(duì)肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MDRla、MDRlb、MDR2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。 2.肝組織MRP1 mRNA和MRP2 mRNA表達(dá)模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，MRP2 mRNA表達(dá)下降，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRP1 mRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對(duì)肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MRP1、M

17、RP2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。 實(shí)驗(yàn)四：龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)的影響結(jié)果顯示，LD各給藥組白細(xì)胞總數(shù)以及粒細(xì)胞總數(shù)有下降趨勢(shì)，CD18熒光強(qiáng)度明顯低于模型組。 結(jié)論：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為，通過(guò)灌胃ANIT，所建立的模型具有肝內(nèi)、體內(nèi)膽汁淤積，肝酶水平增高，肝細(xì)胞損傷等病理生理特征，與中醫(yī)臨床上以身目黃疸為主要表現(xiàn)的肝膽濕熱證類似，可以作為肝膽濕熱模型。該模型的肝臟組織中MDR及MRP mRNA