縫隙連接蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性研究.pdf

1、目前,腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,具有發(fā)病率高、致殘率高及死亡率高的特點(diǎn)。其中腦梗死占全部腦卒中的60％-80％,而動(dòng)脈粥樣硬化是引起腦梗死的最主要原因的之一。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面的纖維帽或是內(nèi)膜損傷導(dǎo)致斑塊破裂從而發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥如腦梗死等。因此對(duì)AS發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究并對(duì)高危人群采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施,將有助于減少動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生。
　　 近幾十年來人們致力于研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其與炎癥、高

2、血脂等多種因素相關(guān),但其具體作用機(jī)制仍不甚明確。血管壁由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及基質(zhì)等組成,這些成分組成一個(gè)統(tǒng)一體,但若要具有相應(yīng)的功能則需相互間進(jìn)行化學(xué)和電信號(hào)的交換。在這些信息通訊通路中,一個(gè)重要途徑就是縫隙連接通訊?？p隙連接是縫隙連接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),是由縫隙連接蛋白組成的細(xì)胞膜通道,允許離子、小的分子物質(zhì)以及第二信使在兩個(gè)相鄰細(xì)胞間進(jìn)行交換。近年來人們發(fā)現(xiàn)縫隙連接與AS密切相關(guān),但其作用機(jī)制尚不清楚。
　　 另外,最近對(duì)縫

3、隙連接蛋白37基因多態(tài)與AS及冠心病、心肌梗死之間進(jìn)行了大量相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)Cx37 C1019T位點(diǎn)是AS的“單基因標(biāo)志物”,與冠心病、心肌梗死密切相關(guān)。而與冠心病和心肌梗死一樣以動(dòng)脈粥樣硬化性為病理基礎(chǔ)的腦梗死是否與Cx37基因多態(tài)相關(guān)?目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 因此我們通過觀察氧化型低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和縫隙連接抑制劑辛醇對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)的影響,從細(xì)胞水平研究縫隙連接與AS的關(guān)系,并進(jìn)一步探討其

4、中的機(jī)制。另外還在基因水平研究了Cx37基因多態(tài)和動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性。
　　 第一部分 OX-LDL、HDL、辛醇o(jì)ctanol對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白和細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVE-12,用ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,建立動(dòng)脈粥樣硬化損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型,觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡和線粒體凋亡途徑的影響,同時(shí)用HDL或octanol和ox-LDL共孵育對(duì)內(nèi)皮

5、細(xì)胞Cx表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。
　　 方法:無菌培養(yǎng)HUVE-12,實(shí)驗(yàn)分為7組:①對(duì)照組:普通DMEM培養(yǎng)基;②～④ox-LDL組:培養(yǎng)基中分別加入終濃度為25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL孵育24小時(shí);⑤HDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mlHDL孵育24小時(shí);⑥HDL+ox-LDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為100μg/mlHDL和50μg/ml ox-LDL共同孵育24小時(shí);⑦o

6、ctanol+ox-LDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為1mM octanol和50μg/mlox-LDL共同孵育24小時(shí)。分別用免疫細(xì)胞化學(xué)方法(Immunocytochemistry,ICC)、western blot方法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx37、Cx40和Cx43以及Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白和相應(yīng)mR

7、NA的表達(dá);MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖,臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性和存活率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:1、與對(duì)照組比較,25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組內(nèi)皮細(xì)胞上縫隙連接蛋白Cx37、Cx40蛋白和mRNA的表達(dá)水平下調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào),其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組細(xì)胞增殖受到明顯抑制,細(xì)胞凋

8、亡率顯著增加,細(xì)胞存活率下降,與對(duì)照組比較,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),促凋亡基因Bax和凋亡蛋白caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與對(duì)照組比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、與對(duì)照組比較,HDL組Cx37、Cx40蛋白和mRNA表

9、達(dá)水平均上調(diào),Cx43 mRNA表達(dá)水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HDL組明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡率顯著下降,細(xì)胞存活率增加,與對(duì)照組比較,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),促凋亡基因Bax和凋亡蛋白caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與對(duì)照組比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與50μg/ml ox-

10、LDL組比較,HDL+ox-LDL組Cx37、40蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與50μg/ml ox-LDL組比較,HDL+ox-LDL組細(xì)胞增殖并未受抑制,細(xì)胞凋亡率下降,細(xì)胞存活率增加,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào),促凋亡基因Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),凋亡蛋白caspase-3

11、mRNA表達(dá)水平下調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與50μg/ml ox-LDL組比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、與50μg/ml ox-LDL組比較,octanol+ox-LDL組Cx37、Cx40蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);octanol+ox-LDL組細(xì)胞增殖抑制率下降,細(xì)胞凋亡率下降,細(xì)胞存活率增加,與50μg/ml ox-

12、LDL組比較,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào),促凋亡基因Bax、凋亡蛋白caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與500μg/ml ox-LDL組比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1、ox-LDL可以影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Cx蛋白及mRNA表達(dá),且呈劑量依賴性,表明ox-LDL可能通過內(nèi)皮細(xì)胞Cx的重構(gòu)

13、參與AS的發(fā)生和發(fā)展。Ox-LDL能明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促其凋亡,且這種作用與濃度相關(guān);其作用機(jī)理可能與線粒體凋亡途徑Bcl-2\Bax\Caspase-3有關(guān),ox-LDL可能通過線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而參與AS的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　 2、HDL能逆轉(zhuǎn)ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白和線粒體凋亡途徑的影響。HDL和ox-LDL在AS中起相反的作用可能與其通過縫隙連接蛋白對(duì)線粒體凋亡途徑產(chǎn)生不同的影響有關(guān)。

14、r>　　 3、縫隙連接抑制劑octanol可逆轉(zhuǎn)ox-LDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白及mRNA的表達(dá)水平的影響,阻斷縫隙連接后可以抑制OX-LDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用,且這種作用可能與線粒體凋亡途徑的Bcl-2\Bax\Caspase-3有關(guān)。Ox-LDL可能通過縫隙連接介導(dǎo)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,促進(jìn)AS的形成和發(fā)展。
　　 第二部分縫隙連接蛋白Cx37基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性研究

15、
　　 目的：探討Cx37 C1019T和I1297D基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。
　　 方法：通過病例一對(duì)照研究設(shè)計(jì),采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)方法檢測(cè)145例健康對(duì)照組人群、245例動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherothrombitic

16、 cerebralinfarction,ACI)患者Cx37基因C1019T和I1297D位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。
　　 結(jié)果：1、湖南漢族人群中存在Cx37 C1019T和I1297D基因多態(tài)位點(diǎn),對(duì)照組人群中,Cx37 C1019T三種基因型CC、CT和TT頻率分別是63.3％、29.0％和9.7％,C和T等位基因頻率分別是77.9％和22.1％;Cx37I1297D三種基因型II、ID和DD頻率分別是47.7％,42.6％和

17、9.7％,I和D等位基因頻率分別是69.0％和31.0％。
　　 2、Cx37 C1019T在ACI組三種基因型CC、CT和TT頻率分別是70.6％,25.7％和3.7％,C和T等位基因頻率分別是83.5％和16.5％,與對(duì)照組比較,兩組基因型頻率和等位基因頻率無顯著性差異(x2=3.765,P=0.152和x2=3.692,P=0.055)。ACI組Cx37 I1297D三種基因型II、ID和DD頻率是45.3％,42.9％和