蟾酥軟膏對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗炎鎮(zhèn)痛作用及機(jī)理研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞑橛卸嘞到y(tǒng)受累的慢性炎癥性疾病，發(fā)病率仍呈上升趨勢，市場上對治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效藥物需求極大。目前西醫(yī)抗RA常用一、二線藥物和糖皮質(zhì)激素，但這些藥物大多毒副作用和不良反應(yīng)較大，依賴性強(qiáng)。為此尋找一種安全、有效、可控，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和改善癥狀的中藥新制劑具有積極意義。 采用蟾酥制成軟膏劑，選用透皮給藥方法可避免肝臟首過效應(yīng)和胃腸道破壞，不受胃腸道酶、消化液、pH值等諸多因素的影響

2、，可提高生物利用度，達(dá)到既可延長藥物作用時(shí)間，又可降低藥物毒性和副作用，維持穩(wěn)定而持久的血藥濃度的目的，為RA患者提供一個(gè)更有效的治療方法。 本課題研究目的是探索蟾酥軟膏對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗炎鎮(zhèn)痛的藥效作用，并考察對關(guān)節(jié)的病理影響，為治療RA提供一個(gè)更有效的方法，并擴(kuò)大蟾酥的用藥途徑。 方法： 本課題實(shí)驗(yàn)研究分為三個(gè)部分： 1.蟾酥軟膏的鎮(zhèn)痛作用研究 1.1 熱板法 取SPF級18～22g痛

3、閾5～30sNIH小鼠，雌性，隨機(jī)分5組，即空白對照組、陽性對照組(法斯通凝膠)、3％、6％、12％蟾酥軟膏組，各組小鼠腹部剃毛，空白組外涂卡波姆基質(zhì)0.1g/只，陽性對照組外涂法斯通0.1g/只，其余給藥組外涂各濃度蟾酥軟膏0.1g/只，每天涂藥1次，連續(xù)7天，末次涂藥后30,60,90min各把小鼠放在預(yù)熱至50℃的智能熱板儀上，以小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期為痛閾指標(biāo)，比較各組差異。 1.2 扭體法 取SPF級18～22

4、gNIH小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組、3％蟾酥軟膏組、6％蟾酥軟膏組和12％蟾酥軟膏組，腹部剃毛后分別外涂該組藥物0.1g/只/天，連續(xù)7天，末次涂藥后1h腹腔注射0.6％醋酸生理鹽水0.01ml/g體重，觀察并記錄30min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體次數(shù)，比較各組差異。 2.蟾酥軟膏的抗炎作用研究 2.1 蟾酥軟膏對蛋清所致大鼠足腫脹的影響 SPF級體重180～220g SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白

5、對照組、陽性對照組、3％、6％和12％蟾酥軟膏組。先用足趾容積測量儀測量大鼠后肢足趾容積，然后分別足趾部外涂該組藥物1g/只/天，連續(xù)7天，末次涂藥后1h每鼠右后足跖皮下注射新鮮蛋清0.2ml，分別于1、2、3、4h測量大鼠后肢足趾容積各一次，計(jì)算足趾腫脹程度，比較各組差異。 2.2 蟾酥軟膏對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 SPF級體重18～22g NIH小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組、3％、6％和12％

6、蟾酥軟膏組，腹部剃毛分別外涂該組藥物0.1g/只/天，連續(xù)7天，末次涂藥后1h每只小鼠均尾靜脈注射0.5％伊文思藍(lán)0.01ml/g體重，隨即腹腔注射0.6％醋酸生理鹽水0.2ml/只，20min后脫頸椎處死，剖開腹腔，用5ml生理鹽水洗滌數(shù)次，收集洗液并調(diào)整終體積至8ml，離心，取上清液于分光光度計(jì)590nm測吸光度，比較各組差異。 2.3 蟾酥軟膏對大鼠棉球肉芽腫的影響 SPF級體重180～220g SD大鼠，雌雄各半

7、，隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組、3％、6％和12％蟾酥軟膏組。大鼠乙醚淺麻醉，腹部用碘酒消毒，75％酒精棉球脫碘，切1cm長小口，取兩個(gè)20±1mg高壓滅菌棉球分別植入大鼠兩側(cè)腋窩皮下，隨即縫合皮膚。手術(shù)當(dāng)日始分別外涂該組藥物0.1g/只/天，連續(xù)7天，末次給藥后脫頸椎處死，取出棉球，剔除脂肪組織，放烘箱60℃烘干，稱重，減去原棉球重量即得肉芽腫凈重。 2.4 蟾酥軟膏對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的影響 SPF級體重180～

8、220g SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組、3％、6％和12％蟾酥軟膏組。模型組、陽性對照組、3％、6％和12％蟾酥軟膏組每鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐劑0.1ml，空白對照組大鼠右后足跖皮下注射生理鹽水0.1ml，然后分別外涂該組藥物1g/只/天，連續(xù)7天。觀察指標(biāo)： a．足趾腫脹程度的測量：造模前先用足趾容積測量儀測量大鼠后肢足趾容積，此后隔周測量大鼠右后肢足趾容積各一次，計(jì)算足趾腫脹程度，比較各組

9、差異。 b．足跖組織液IL-1β、TNF-α、PGE<,2>的含量測定：末次涂藥后1h，剝離足跖關(guān)節(jié)皮毛、肌肉，取足跖關(guān)節(jié)剝除趾骨后將組織勻漿，測定大鼠足跖組織液IL-1β、INF-α、PGE<,2>的含量。 c．血清SOD活力的檢測：末次涂藥后1h，每只動(dòng)物從心臟抽血1ml離心取血清按SOD測試盒方法檢測大鼠血清SOD活力。 d．血沉的測定：末次涂藥后1h，每只動(dòng)物從心臟抽血1.6ml加入0.4ml枸櫞酸鈉抗凝

10、劑，吸入血沉管至“0”刻度處，將血沉管直立在血沉架上記時(shí)，在室溫22℃下靜置1h，觀察記錄紅細(xì)胞下沉mm數(shù)。 e．足跖關(guān)節(jié)病理觀察：末次涂藥后1h將大鼠放清體血，剝離足趾關(guān)節(jié)皮毛、肌肉、肌腱組織并暴露關(guān)節(jié)，取足趾關(guān)節(jié)剝除滑膜后以中性福爾馬林固定。EDTA液脫鈣2周后石蠟包埋，切片HE染色檢測，觀察軟骨缺損范圍深度、纖維組織增生、軟骨炎細(xì)胞浸潤等。 3.皮膚毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 3.1 皮膚急性毒性試驗(yàn)研究 普通

11、級新西蘭兔，雌雄各半，體重2.0kg左右，隨機(jī)分成對照組(卡波姆基質(zhì))和試驗(yàn)組(21.6％蟾酥軟膏，為最大可溶濃度)：完整皮膚組和破損皮膚組。取每種受試藥物3g分別均勻涂于脫毛區(qū)，并用無刺激性紗布及繃帶加以固定。給予受試藥物24小時(shí)，去除受試物后1，24，48，72小時(shí)至第七日，每日觀察并記錄動(dòng)物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和粘膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等及其他中毒表現(xiàn)。 3.2 皮膚刺激性試驗(yàn)研究 動(dòng)物：普通級新西

12、蘭兔，雌雄各半，體重2.0kg左右。 a．完整皮膚的局部刺激性試驗(yàn)：試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對比，左側(cè)去毛區(qū)涂受試藥21.6％蟾酥軟膏1g，右側(cè)去毛區(qū)涂卡波姆基質(zhì)1g，并用無刺激性紗布及繃帶加以固定。其中單次給藥刺激性試驗(yàn)在涂藥24h后，用溫水洗去殘留藥物，去除受試藥物后1h，24 h，48h，72h．肉眼觀察皮膚反應(yīng)；多次給藥刺激性試驗(yàn)連續(xù)給藥7天，再停藥7天。除觀察、記錄每日的紅斑及水腫情況還應(yīng)觀察涂藥部位是否有色素沉著、出血

13、點(diǎn)、皮膚粗糙或者皮膚菲薄等情況。 b．破損皮膚的局部刺激性試驗(yàn)：試驗(yàn)前24h，用脫毛劑將兔背部脊柱兩側(cè)脫毛后再用細(xì)砂紙摩擦造成局部擦傷，以局部滲血為度，左右兩側(cè)皮膚的破損程度應(yīng)基本一致。其余步驟同完整皮膚局部刺激性試驗(yàn)。 3.3 皮膚致敏試驗(yàn)研究 普通級白化豚鼠，雌雄各半，體重200g～250g，隨機(jī)均分為空白對照組(卡波姆基質(zhì))、陽性對照組(1％2,4-二硝基氯代苯)和試驗(yàn)組(21.6％蟾酥軟膏)共3組，雌雄各

14、半。致敏接觸：于左側(cè)褪毛區(qū)，空白對照組涂卡波姆基質(zhì)0.2g，陽性對照組涂1％的DNCB 0.2ml，試驗(yàn)組涂21.6％蟾酥軟膏0.2g。所有動(dòng)物涂藥后，用無菌紗布覆蓋，無刺激膠布封閉、固定，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，維持6h，于涂藥后第7天和第14天，以同樣的方法重復(fù)涂藥一次。激發(fā)接觸：于末次給藥后第14天，先用溫水洗凈右側(cè)褪毛區(qū)，空白對照組涂卡波姆基質(zhì)0.2g，陽性對照組涂0.1％的DNCB 0.2ml，試驗(yàn)組涂21.6％蟾酥軟膏0.2g。分別于

15、給藥6h、24b、48h、72h觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，記錄各時(shí)間點(diǎn)所有動(dòng)物的過敏反應(yīng)分值，同時(shí)注意觀察動(dòng)物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)。 結(jié)論： 通過熱板法和扭體法實(shí)驗(yàn)，說明了三個(gè)濃度蟾酥軟膏均一定的鎮(zhèn)痛作用，尤以6％蟾酥軟膏作用最明顯。 采用蛋清致大鼠足趾腫脹，蟾酥軟膏各濃度組均能減輕足趾腫脹程度，對一般性炎癥有一定抗炎作用。小鼠腹腔注射醋酸能使毛細(xì)血管通透性增加，蟾酥軟膏可抑制這種作用，緩

16、解毛細(xì)血管液體滲出。蟾酥軟膏對大鼠棉球植入引起的肉芽腫增生有明顯的抑制作用。 采用弗氏完全佐劑大鼠足趾部注射造成大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎，蟾酥軟膏各濃度組均能減輕足趾腫脹程度，有一定抗炎作用。蟾酥軟膏可以有效減少佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織液IL-1β、TNF-α和PGE<,2>的含量，從而抑制它們的致炎作用，減緩炎癥滲出及軟骨破壞。蟾酥軟膏能增強(qiáng)SOD活力，使自由基歧化而清除，減緩炎癥損傷。90％類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血沉加快，可能由于炎癥分子引

17、起的纖維蛋白原的激活而使血紅細(xì)胞沉降速度加快，蟾酥軟膏能減緩血沉速度的加快。足跖關(guān)節(jié)病理切片光鏡下觀察，與模型組比較，陽性對照組和6％、12％蟾酥軟膏組大鼠足跖軟骨關(guān)節(jié)破壞較輕，炎性浸潤和纖維組織增生不及模型組嚴(yán)重，說明蟾酥軟膏能防止大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)受炎癥破壞受損。 蟾酥軟膏最大可溶濃度(21.6％)，試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)受試動(dòng)物中毒表現(xiàn)，并無引起受試動(dòng)物出現(xiàn)皮膚刺激性及過敏現(xiàn)象，說明蟾酥軟膏在局部皮膚用藥上是基本安全的。