斑蝥素提取、特異性抗體的制備及其酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

1、斑蝥素（cantharidin），是中藥材斑蝥的有效成分，屬于倍半萜烯類(lèi)天然防御性毒素，由于其獨(dú)特的抗癌性，人們?cè)谄淇拱C(jī)制以及毒理藥理上進(jìn)行了大量的研究，并合成了大量的斑蝥素衍生物。但是，仍然在斑蝥素的生物合成位點(diǎn)、合成途徑已經(jīng)斑蝥素的抗癌機(jī)制上存在許多疑難問(wèn)題。
　　目前，斑蝥素的檢測(cè)方法有重量法、酸堿法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些方法通常需要昂貴的色譜儀器，有的還必須事先對(duì)樣品進(jìn)行繁雜的純化處理，而

2、且對(duì)操作人員的技術(shù)要求很高。
　　然而，隨著免疫學(xué)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法不再僅僅局限于大分子的檢測(cè)，而是日益廣泛的被用于小分子物質(zhì)的檢測(cè)。雖然小分子物資在結(jié)構(gòu)上不具有抗原性，但是通過(guò)與大分子物質(zhì)偶聯(lián)后便具有了抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性。進(jìn)而，就可以構(gòu)建小分子的酶免疫檢測(cè)方法了。
　　研究目的：從斑蝥體內(nèi)提取斑蝥素，以此合成斑蝥素羧基衍生物 N-羧乙基斑蝥酰亞胺，探究合成反應(yīng)最佳條件及產(chǎn)率并比較二者的毒性；通過(guò)斑蝥素和β-丙

3、氨酸合成半抗原N-羧乙基斑蝥酰亞胺，并借助半抗原的偶聯(lián)來(lái)制備人工完全抗原，免疫兔子獲得特異性抗體，最終根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理建立斑蝥素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法及其檢測(cè)曲線。
　　研究方法：以混合提取法、震蕩提取法及快速提取法等方法分別提取斑蝥素，并進(jìn)行比較；在單因素不同的體系中斑蝥素與β-丙氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，且用GC、TLC、UV、MS、NMR等對(duì)提取物及反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并通過(guò)改良寇氏法測(cè)定斑蝥素及其衍生物的LD50以比較其胃毒

4、毒性；以NHS酯法用偶聯(lián)劑DCC、NHS將半抗原 N-羧乙基斑蝥酰亞胺偶聯(lián)到載體蛋白上，用摩爾吸光系數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)偶聯(lián)成功后，用斑蝥素人工完全抗原免疫兔子；ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1：3200后分離血清，并用CNBr活化的瓊脂糖凝膠4B親和層析對(duì)抗血清中的進(jìn)行純化，對(duì)于純化的結(jié)果借用SDS-PAGE以及ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)；將純化的斑蝥素特異性抗體及斑蝥素人工完全抗原采用間接競(jìng)爭(zhēng)法構(gòu)建斑蝥素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，并建立檢

5、測(cè)曲線，探討該檢測(cè)曲線的檢測(cè)范圍及其極限，用GC法來(lái)驗(yàn)證蝥素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法在檢測(cè)斑蝥粗提物斑蝥素的含量中的準(zhǔn)確性與可靠性。
　　研究結(jié)果：混合提取法得到的斑蝥素純度達(dá)98.53％，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定可以確認(rèn)縮合產(chǎn)物為N-羧乙基斑蝥酰亞胺；縮合反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件：n（斑蝥素）/n（β-丙氨酸）=1/1.2；媒介溶劑與催化劑均為Et3N，最佳用量為1 mol的斑蝥素需72 ml的Et3N，125～150℃下脫水反應(yīng)4～5 h，產(chǎn)率

6、可達(dá)74.40%。衍生物對(duì)小鼠的胃毒性僅為斑蝥素毒性的1/400；經(jīng)過(guò)鑒定，采取 NHS酯法得到的人工完全抗原中半抗原N-羧乙基斑蝥酰亞胺與載體蛋白BSA、OVA的結(jié)合比分別為25:1、23:1；兔抗血清的效價(jià)在純化之前為1:3200，純化后達(dá)到1:6400～1:12800，為純化前的2～4倍；斑蝥素間接接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法及其測(cè)定曲線為y=-0.0697x+0.1894，該曲線的檢測(cè)范圍是2.4 mg/ml～2.4 mg/L，并且