若干中藥組分對香煙煙霧暴露所致慢性阻塞性肺疾病炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 經(jīng)過長期的科研及臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益氣方藥能夠治療氣道等的炎癥性疾病。中藥經(jīng)驗(yàn)方劑補(bǔ)腎益氣方(淫羊藿、黃芪、生地)和補(bǔ)腎益氣清熱方(淫羊藿、黃芪、黃芩、生地)是本研究團(tuán)隊(duì)在診療哮喘、COPD等慢性呼系統(tǒng)炎癥性疾病的過程中總結(jié)出的有效方劑，它對中醫(yī)辨證為腎陽虛、腎氣虛或肺腎兩虛或兼痰熱郁肺之侯的COPD和哮喘患者有較好的療效。
　　 我們對補(bǔ)腎組分淫羊藿苷和清熱組分黃芩苷的前期實(shí)驗(yàn)己證實(shí)淫羊藿苷對抑制脂多

2、糖、卵蛋白等誘導(dǎo)的炎癥確切有效，黃芩苷對抑制香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的炎癥確切有效，黃芪甲苷、生地梓醇等也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)對支氣管炎、心肌炎、肝炎等炎癥反應(yīng)有良好的抑制作用。但國內(nèi)外對淫羊藿苷、黃芩苷、黃芪甲苷和生地梓醇在香煙誘導(dǎo)產(chǎn)生的COPD炎癥反應(yīng)中作用如何及影響機(jī)制尚未有廣泛研究。
　　 結(jié)合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中淫羊藿、黃芪、黃芩及生地在治療肺脹、咳嗽、喘證的重要作用以及本團(tuán)隊(duì)對補(bǔ)。腎益氣方和補(bǔ)腎益氣清熱方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及確切臨床療效的認(rèn)識，我們

3、通過觀察中藥補(bǔ)腎組分淫羊藿苷、益氣組分黃芪甲苷、清熱組分黃芩苷和滋腎組分生地梓醇對香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎癥反應(yīng)的作用，探索中藥有效組、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇抑制CS所致的炎癥反應(yīng)的部分分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.建立香煙煙霧(CS)誘導(dǎo)的小鼠COPD炎癥反應(yīng)模型，并采用中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷、生地梓醇和補(bǔ)腎益氣組分方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇合方)進(jìn)行干預(yù)。隨機(jī)將小鼠分為

4、18組，每組10只，分別是正常對照組、COPD模型組、COPD+地塞米松組(1mg/kg)組、COPD+淫羊藿苷高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg)、COPD+黃芪甲苷高、中、低劑量組(40、20、10mg/kg)、COPD+黃芩苷高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg)、COPD+生地梓醇高、中、低劑量組(20、10、5mg/kg)、COPD+(淫羊藿苷+黃芪甲苷+生地梓醇)高、中、低劑量組。采用連續(xù)香煙煙霧暴露法

5、建立小鼠COPD模型；測定小鼠實(shí)驗(yàn)開始前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時的體重；采用WBP全身體積描計儀檢測各組小鼠肺功能；采用H&E染色制成病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤、病理學(xué)評分、平均內(nèi)襯間隔(MLI)、肺泡破壞指數(shù)(DI)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清及肺泡灌洗液(BALF)中IL-8、TNF-α、MMP-9的水平；采用免疫組織化學(xué)染色檢測各組小鼠肺組織組蛋白去乙?；?(HDAC2)和糖皮質(zhì)激素受體(G

6、R)表達(dá)；采用Western blot法檢測各組小鼠肺組織HDAC2蛋白及磷酸化的HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κB P65蛋白、磷酸化的P65蛋白及IκB-α蛋白表達(dá)；采用HDAC2活性檢測試劑盒檢測各組小鼠肺組織HDAC2活性變化。
　　 2.建立香煙提取液(CSE)干預(yù)A549細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)模型，并采用中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇進(jìn)行干預(yù)。觀察幾種中藥對CSE誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用時，細(xì)胞分

7、組為：Control，CSE，CSE+淫羊藿苷(1、10、50μM)，CSE+黃芪甲苷(1、10、50μM)，CSE+黃芩苷(1、10、50μM)，CSE+生地梓醇(1、10、50μM)、CSE+地塞米松(1μM)。采用CCK-8試劑盒檢測藥物對細(xì)胞的增殖與毒性作用；采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平；采用Western blot法檢測細(xì)胞HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κB P65蛋白表達(dá)；采用HD

8、AC2活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞HDAC2活性變化；采用real-time PCR檢測細(xì)胞HDAC2 mRNA和GR mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.香煙煙霧暴露可明顯減輕小鼠體重，損傷小鼠肺功能從而降低小鼠PEF、PIF及MV，導(dǎo)致小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤、肺組織結(jié)構(gòu)改變及肺氣腫發(fā)生，并能顯著升高小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平，損傷小鼠肺組織HDAC2活性及蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)HDAC2磷酸化，

9、降低小鼠肺組織GR蛋白表達(dá)，增強(qiáng)P65磷酸化、降低IκB-α表達(dá)從而激活NF-κB信號通路(P<0.05)。香煙煙霧提取液刺激A549細(xì)胞可誘導(dǎo)類似的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高，并能降低細(xì)胞核HDAC2的活性及蛋白表達(dá)，抑制GR mRNA表達(dá)，激活NF-κB信號通路(P<0.05)。
　　 2.淫羊藿苷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能恢復(fù)COPD小鼠體重，保護(hù)COPD小鼠肺功能從而提高小鼠PEF、PIF及M

10、V，降低MLI和DI從而減輕COPD小鼠肺氣腫情況，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，抑制COPD小鼠肺組織NF-κB P65磷酸化和增強(qiáng)IκB-α表達(dá)，增強(qiáng)HDAC2活性及蛋白表達(dá)并抑制HDAC2磷酸化、促進(jìn)GR表達(dá)(P<0.05)。
　　 3.黃芪甲苷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能恢復(fù)COPD小鼠體重，降低MLI和DI從而減輕香煙煙霧暴露所致的COPD小鼠肺氣腫情

11、況，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液(BALF)中MMP-9的水平、BALF中TNF-α的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，抑制NF-κB P65磷酸化(P<0.05)，但對IκB-α蛋白無明顯作用(P>0.05)。
　　 4.黃芩苷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能恢復(fù)COPD小鼠體重，保護(hù)COPD小鼠肺功能從而提高小鼠PEF、PIF及MV，降低MLI和DI從而減輕COPD小鼠肺氣腫情況，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TN

12、F-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，抑制COPD小鼠肺組織NF-κB P65磷酸化和增強(qiáng)IκB-α表達(dá)，增強(qiáng)HDAC2活性及蛋白表達(dá)并抑制HDAC2磷酸化(P<0.05)。黃芩苷對COPD小鼠GR蛋白表達(dá)無明顯作用(P>0.05)。
　　 5.生地梓醇體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能恢復(fù)COPD小鼠體重，減輕COPD小鼠肺氣腫情況，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD

13、小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)COPD小鼠肺組織下調(diào)的GR蛋白表達(dá)，恢復(fù)IκB-α蛋白表達(dá)(P<0.05)，但對P65磷酸化無明顯作用(P>0.05)。
　　 6.組分復(fù)方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇)能保護(hù)COPD小鼠肺功能，恢復(fù)COPD小鼠體重，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(P<0.05)。因此，三藥組分復(fù)方對CS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也有抑制作用。<

14、br>　　 7.地塞米松體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其干預(yù)COPD小鼠3個月后會導(dǎo)致小鼠體重明顯減輕，地塞米松干預(yù)不僅未能恢復(fù)COPD小鼠肺功能，而且還降低了COPD小鼠的肺功能。地塞米松能抑制COPD小鼠血清及BALF中IL-8和TNF-α水平(P<0.05)，但未能顯著降低COPD小鼠血清及BALF中MMP-9水平(P>0.05)，也未能明顯減輕COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(P>0.05)。地塞米松能抑制NF-κB P65磷酸化(P<0.05)

15、，但對IκB-α蛋白表達(dá)的上調(diào)作用不十分明顯(P>0.05)。地塞米松能恢復(fù)CS誘導(dǎo)的HDAC2活性(P<0.05)，但是對COPD小鼠肺組織HDAC2蛋白表達(dá)上調(diào)作用不十分明顯(P>0.05)。地塞米松對COPD小鼠肺組織表達(dá)GR蛋白的作用，經(jīng)免疫組化顯示地塞米松無明顯上調(diào)GR表達(dá)的作用(P>0.05)，經(jīng)Western blot檢測證實(shí)可以明顯上調(diào)GR表達(dá)(P<0.05)。
　　 8.淫羊藿苷體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能抑制CSE刺激的

16、A549細(xì)胞釋放IL-8和TNF-α，抑制NF-κB P65蛋白表達(dá)，增強(qiáng)HDAC2活性及蛋白表達(dá)、促進(jìn)GR mRNA表達(dá)(P<0.05)。
　　 9.黃芪甲苷體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)能抑制CSE刺激的A549細(xì)胞釋放IL-8和TNF-α，抑制NF-κB P65表達(dá)(P<0.05)，可見黃芪甲苷可能是通過P65及磷酸化的途徑來抑制CS誘導(dǎo)的NF-κB激活。黃芪甲苷雖能恢復(fù)HDAC2活性(P<0.05)，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能上調(diào)HDAC2蛋白表達(dá)

17、(P<0.05)，但未在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，因此其對HDAC2的影響不明確。
　　 10.黃芩苷體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能抑制CSE刺激的A549細(xì)胞釋放IL-8和TNF-α，抑制NF-κB P65表達(dá)，增強(qiáng)HDAC2活性及蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　 11.生地梓醇體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)能抑制CSE刺激的A549細(xì)胞釋放IL-6、IL-8和TNF-α，促進(jìn)GR mRNA的表達(dá)(P<0.05)。生地梓醇雖能恢復(fù)HDAC2活性，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

18、證實(shí)能上調(diào)HDAC2蛋白表達(dá)(P<0.05)，但未在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，因此其對HDAC2的影響尚需考察。
　　 12.地塞米松體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在CSE誘導(dǎo)的A549炎癥反應(yīng)模型中，對細(xì)胞釋放IL-8的抑制作用不如地塞米松在TNF-α誘導(dǎo)的A549炎癥反應(yīng)模型中對IL-8的抑制作用。地塞米松對CSE干預(yù)的A549細(xì)胞表達(dá)HDAC2蛋白有上調(diào)作用(P<0.05)，但這一結(jié)果未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。
　　 結(jié)論：
　　

19、 1.本實(shí)驗(yàn)中，香煙煙霧暴露可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生COPD炎癥反應(yīng)，減輕小鼠體重，降低小鼠肺功能，導(dǎo)致小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤及肺氣腫發(fā)生，并能顯著升高小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平，損傷小鼠肺組織HDAC2作用及GR表達(dá)，激活NF-κB信號通路。香煙煙霧提取液刺激A549細(xì)胞可誘導(dǎo)類似的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高，并能損傷細(xì)胞核HDAC2作用及GR表達(dá)，激活NF-κB信號通路。

20、因此，HDAC2、GR和NF-κB信號通路均參與了CS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，且HDAC2的作用損傷和GR的表達(dá)降低可能間接促進(jìn)了NF-κB活化程度的增強(qiáng)。
　　 2.補(bǔ)腎組分淫羊藿苷對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB活化、恢復(fù)HDAC2的作用以及促進(jìn)GR表達(dá)途徑實(shí)現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κB P65磷酸化及增強(qiáng)IκB-α表達(dá)有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑

21、制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其能抑制MMP-9的水平有關(guān)。
　　 3.益氣組分黃芪甲苷對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有部分抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB活化途徑實(shí)現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κB P65磷酸化有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與其抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其抑制MMP-19的水平有關(guān)。
　　 4.清熱組分黃芩苷對香煙煙霧暴露

22、所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB活化以及恢復(fù)HDAC2作用途徑實(shí)現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κB P65磷酸化及增強(qiáng)IκB-α表達(dá)有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其能抑制MMP-9的水平有關(guān)。
　　 5.滋腎組分生地梓醇對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB活化以及促進(jìn)GR表達(dá)途徑實(shí)現(xiàn)

23、的。其抑制NF-κB活化的作用與其增強(qiáng)IκB-α表達(dá)有關(guān)；其降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其抑制MMP-9的水平有關(guān)。
　　 6.組分復(fù)方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇)能保護(hù)COPD小鼠肺功能，抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤。因此，三種中藥組分的復(fù)方對香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也有

24、抑制作用。
　　 7.中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇以及組分復(fù)方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇組方)對香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的COPD小鼠炎癥模型或CSE誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥模型的炎癥反應(yīng)均有不同程度的抑制作用，其中黃芪甲苷拮抗炎癥的作用不如淫羊藿苷、黃芩苷和生地梓醇。
　　 8.本實(shí)驗(yàn)中，地塞米松能部分、但不能完全有效地抑制香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這與國外的研究基本一致。原因之一是香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的炎癥反