PrxⅢ在去甲腎上腺素誘導(dǎo)H-,9-C-,2-細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)變化.pdf

1、心力衰竭是各種心臟病進(jìn)展的惡性歸宿之一，其發(fā)病率和死亡率在世界各地均很高。心肌細(xì)胞的增生能力有限且數(shù)目相對(duì)固定，故心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中的重要作用已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，已經(jīng)成功的建立了多種動(dòng)物模型來(lái)研究心力衰竭過(guò)程中的心肌細(xì)胞凋亡。但是由于動(dòng)物模型在研究心力衰竭發(fā)生機(jī)制中的局限性，體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，是研究心肌細(xì)胞生理和病理機(jī)制的重要手段。但心肌細(xì)胞是終分化細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞不易傳代，故體外大量培養(yǎng)難度大，從而限

2、制了其應(yīng)用范圍。大鼠心肌干細(xì)胞系H9C2在一定范圍可替代原代心肌細(xì)胞。 氧化應(yīng)激在心力衰竭發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，活性氧族(reactive oxvgen species ROS)可損傷細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)(如DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì))，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)是交感神經(jīng)主要神經(jīng)遞質(zhì)，是心肌細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中不可缺少的分子，能以時(shí)間一劑量依賴的方式刺激心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，它不僅可以誘導(dǎo)心肌

3、細(xì)胞肥大，高濃度時(shí)還可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。 PrxⅢ(Peroxiredoxin Ⅲ)是特異性定位于線粒體的硫氧化蛋白依賴的過(guò)氧化氫酶，其主要功能是清除線粒體內(nèi)氧化磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生的ROS，從而保護(hù)免受氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮其抗調(diào)亡作用。 本實(shí)驗(yàn)選取該H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，利用高濃度NE誘導(dǎo)，觀察其凋亡變化，以及在H9C2細(xì)胞凋亡中，PrxⅢ的表達(dá)變化，以探討PrxⅢ與H9C2細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。 目的： 建立

4、NE誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡模型，檢測(cè)PrxⅢ在凋亡H9C2細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究NE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制和PrxⅢ的功能奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.H9C2細(xì)胞的培養(yǎng)：含10％FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM的培養(yǎng)液基，5％CO2、37℃環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞融合至70-80％時(shí)，用含0.02％EDTA的胰蛋白酶消化液進(jìn)行傳代。 2.建立H9C2細(xì)胞凋亡模型：H9C2細(xì)胞傳代24h后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

5、24h后，NE處理組加入含0.5％FBS的培養(yǎng)基后再加入NE至終濃度200μmol/L；NE對(duì)照組加入只含0.5％FBS的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；正常對(duì)照組傳代后繼續(xù)培養(yǎng)48h。 3.倒置顯微鏡下觀測(cè)H9C2細(xì)胞形態(tài)變化。 4 透射電鏡下觀測(cè)H9C2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 5 Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。 6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

6、 7 凋亡心肌細(xì)胞中PrxⅢ mRNA的定量。 結(jié)果： 1.光鏡下觀察結(jié)果。 正常對(duì)照組和NE對(duì)照組細(xì)胞呈正常細(xì)胞形態(tài)。NE處理組可見(jiàn)較多細(xì)胞呈現(xiàn)以凋亡為主的典型形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞呈圓形、半貼壁或漂浮狀，折光性強(qiáng)，細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮、染色質(zhì)濃縮。　　2 透射電鏡下觀察結(jié)果正常對(duì)照組和NE對(duì)照組呈正常細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：核膜完整，染色質(zhì)均勻一致。NE處理組表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)不均勻，邊集；核膜斷裂不完整；胞漿

7、濃縮呈囊泡樣改變并凸向核膜。 3.Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果Hoechest 33258染色后在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)染，凋亡細(xì)胞其細(xì)胞核濃染致密顆粒狀熒光。計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞后計(jì)算，NE處理組細(xì)胞凋亡率(0.4167±0.1450)較NE對(duì)照組(0.208±0.054)明顯增加。 4 MTT法測(cè)細(xì)胞活力NE處理組的細(xì)胞存活率(0.294±0.130)較NE對(duì)照組(1.644±0.464)明顯降

8、低(P＜0.05)。5 PrxIIIⅢmRNA的相對(duì)表達(dá)量的比較NE處理組PrxⅢ mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.3121±0.0380)明顯高于NE對(duì)照組(0.2049±0.0374)(P＜0.05)；正常對(duì)照組PrxⅢ mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.1937±0.0468)與NE對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.本試驗(yàn)證實(shí)用200μmol/L的NE作用H9C2細(xì)胞24h可抑制心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。