去甲腎上腺素和多巴胺在利多卡因致大鼠驚厥過程中的作用.pdf

1、目的：應(yīng)用利多卡因致大鼠中毒驚厥模型，在兒茶酚胺合成限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抑制劑α-甲基-ρ-酪氨酸(alpha-methyl-ρ-tyrosine，AMPT)以及去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Norepinephrine transporter，NET)抑制劑地昔帕明的作用下，觀察TH免疫活性以及測定驚厥過程中紋狀體部位細(xì)胞外液去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)與多巴胺(dopam

2、ine，DA)含量，探討去甲腎上腺素與多巴胺在利多卡因致大鼠中毒驚厥過程中的作用。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組及動物模型制備24只Wistar雄性大鼠，體重250±20 g。隨機(jī)分為4組，每組6只。大鼠5％異氟烷(isoflurane)麻醉后氣管插管，手術(shù)過程中持續(xù)吸入3％異氟烷維持麻醉，右股靜脈切開置管以1ml/h的速度輸入乳酸鈉林格氏液。刺入電極持續(xù)監(jiān)測心電圖(ECG)和腦電圖(EEG)。紋狀體定位(A，-1.2 cm；M

3、，-2.8 cm；D，3.5 mm)、鉆顱孔、劃破硬膜，微透析針以此坐標(biāo)點(diǎn)垂直刺入硬膜下腦組織。操作結(jié)束1小時腦電圖波形穩(wěn)定后，以2μl/min的速度注入乳酸鈉林格氏液，收集腦組織微透析液20分鐘，之后按照實(shí)驗(yàn)分組給予不同處理。L組：注射生理鹽水1ml，30分鐘后單次泵入2％利多卡因0.1 ml，見腦電圖無異常棘波繼續(xù)以4mg·kg-1·min-1速度持續(xù)泵入，直到EEG上出現(xiàn)振幅超過100 μV寬大快速的簇狀棘波并持續(xù)10秒以上，停止

4、輸入利多卡因。A+L組：在泵入利多卡因前30分鐘經(jīng)腹腔注射α-甲基-ρ-酪氨酸(alpha-methyl-o-tyrosineAMPT)溶液，輸入利多卡因的量和速度以及停止時間均與L組相同。D+L組：在泵入利多卡因前30分鐘，腹腔注射地昔帕明20mg/kg，余操作同L組。C組：與L組相比僅在泵入利多卡因時泵入相同劑量的乳酸鈉林格氏液，余操作均與其相同。記錄驚厥波發(fā)生及持續(xù)時間、呼吸抑制及持續(xù)時間。分別在微透析針置入60分鐘及L組出現(xiàn)驚厥

5、波時(其他三組于相應(yīng)時間點(diǎn))兩個時間點(diǎn)采集股動脈血測動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，呼吸抑制期間給予輔助呼吸，維持PaO2和PaCO2在正常范圍。 2.標(biāo)本采集操作結(jié)束1小時待腦電圖波形穩(wěn)定后(T1)收集腦微透析液20分鐘，輸入利多卡因后(T2)再收集20分鐘。實(shí)驗(yàn)后，大鼠深麻醉經(jīng)左心0.9％生理鹽水和4％多聚甲醛溶液各50 ml灌流、固定，完整取出腦組織，浸入4％多聚甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?3.標(biāo)

6、本的檢測方法 3.1 免疫組織化學(xué)染色法：腦組織切片5μm、脫蠟，經(jīng)抗原修復(fù)滴加試劑、抗體，經(jīng)DAB染色在顯微鏡下觀察顯色，每個切片在高倍鏡下取4個視野進(jìn)行TH陽性細(xì)胞計數(shù)并計算平均值。 3.2高效液相色譜-熒光檢測法測定腦微透析液NE、DA的含量樣品測定：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得去甲腎上腺素、鹽酸多巴胺的濃度與峰面積回歸方程，對樣品進(jìn)行測定求得去甲腎上腺素、鹽酸多巴胺的峰面積，檢測探針回收率，按照回歸方程、探針回收率及鹽酸多

7、巴胺與多巴胺的換算關(guān)系計算大鼠腦紋狀體去甲腎上腺素、多巴胺的實(shí)際含量。 結(jié)果： 1.各組呼吸抑制持續(xù)時間比較C組和A+L組均無呼吸抑制；L組呼吸抑制持續(xù)時間為21.83±1.69分鐘；D+L組呼吸抑制持續(xù)時間為14.67±1.37分鐘。與L組比較，D+L組呼吸抑制持續(xù)時間明顯減少(P<0.05)。 2.各組棘波持續(xù)時間比較C組無棘波出現(xiàn)，L組棘波持續(xù)時間為25.67±0.75分鐘；A+L組棘波持續(xù)時間為8.33±

8、1.13分鐘；D+L組棘波持續(xù)時間為13.5±2.07分鐘。與L組比較，A+L組、D+L組棘波持續(xù)時間均減少(P<0.05)；與A+L組比較，D+L組棘波持續(xù)時間延長(P<0.05)。 3.C組、L組、A+L組大鼠大腦黑質(zhì)部位酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞數(shù)比較C組陽性細(xì)胞數(shù)為34.83±1.47個；L組陽性細(xì)胞數(shù)為84.33±3.78個；A+L組陽性細(xì)胞數(shù)為54.00±1.55個。與C組比較，L組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，A+L組陽性細(xì)胞數(shù)亦

9、增加(P<0.05)；與L組比較，A+L組陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。 4.C組、L組、A+L組大鼠腦細(xì)胞外液T2去甲腎上腺素、多巴胺的含量比較 C組去甲腎上腺素、多巴胺的含量分別為351.78±10.15ng/ml，316.80±6.62 ng/ml，L組去甲腎上腺素、多巴胺的含量分別為524.61±17.85 ng/ml，758.42±15.46 ng/ml，A+L組420.68±5.79 ng/ml，483.61±6.

10、24 ng/ml與C組比較，L組去甲腎上腺素、多巴胺的含量均增加(P<0.05)；A+L組去甲腎上腺素、多巴胺的含量均增加(P<0.05)；與L組比較，A+L組去甲腎上腺素、多巴胺的含量均降低(P<0.05)。 5.TH陽性細(xì)胞數(shù)與C組、L組、A+L組棘波持續(xù)時間呈正相關(guān)，直線回歸方程為Y=0.52X-18.65 R2=0.99。 6.三組TH陽性細(xì)胞數(shù)與T2大鼠腦細(xì)胞外液去甲腎上腺素、多巴胺的含量呈正相關(guān)關(guān)系，直線回歸

11、方程分別為Y=3.5X+230.28 R2=1.00；Y=8.87X+7.47 R2=1.00。 7.T2大鼠腦細(xì)胞外液去甲腎上腺素、多巴胺的含量與棘波持續(xù)時間呈正相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程分別為Y=0.15X-52.33R2=0.98：Y=0.06X-19.11 R2=0.99。 8.L組T1與T2去甲腎上腺素、多巴胺含量的比較L組T1去甲腎上腺素含量358.9±9.12ng/ml，多巴胺319.35±6.64ng/ml，

12、T2去甲腎上腺素、多巴胺含量與T1比較明顯升高(P<0.05)9 A+L組T1與T2去甲腎上腺素、多巴胺含量的比較A+L組T1去甲腎上腺素含量357.63±10.58ng/ml，多巴胺319.83±8.58ng/ml，T2去甲腎上腺素、多巴胺含量與T1比較明顯升高(P<0.05)。 結(jié)論： 1.利多卡因致大鼠驚厥過程中紋狀體腦細(xì)胞外液NE、DA 均升高，其原因可能是神經(jīng)元TH免疫活性增強(qiáng)。 2.DA在利多卡因致大