細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與有機(jī)磷遲發(fā)性神經(jīng)病變的關(guān)系研究.pdf

1、目的: 分別以甲胺磷和磷酸三甲苯酯誘發(fā)母雞遲發(fā)性神經(jīng)?。∣PIDN），觀察病理學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)的變化，測(cè)定神經(jīng)病靶酯酶的改變及有關(guān)生化指標(biāo)的變化，檢測(cè)大腦信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相關(guān)蛋白2和β-actin的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，闡明甲胺磷和磷酸三甲苯酯誘發(fā)OPIDN過程中不同信號(hào)蛋白含量水平的改變，為進(jìn)一步探討細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在OPIDN發(fā)生中的作用機(jī)制提供依據(jù)。 方法: 健康成年母雞（魯禽種雞）44

2、只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為甲胺磷造模組（n=20），磷酸三甲苯酯造模組（n=20）和對(duì)照組（n=4）。甲胺磷造模組經(jīng)口給予甲胺磷10mg/（kg·d），連續(xù)給藥14天；磷酸三甲苯酯造模組經(jīng)口給予磷酸三甲苯酯原油1ml/（kg·d），連續(xù)給藥7天，誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)毒性。對(duì)照組動(dòng)物連續(xù)14天經(jīng)口給予生理鹽水1ml/（kg·d）。甲胺磷組、磷酸三甲苯酯組和對(duì)照組母雞于染毒后7d、14d、21d、28d斷頭處死，取血清備用。迅速取

3、出腦、脊髓、坐骨神經(jīng)和腓腸肌，按照常規(guī)要求制備病理及電鏡標(biāo)本。動(dòng)物血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，采用自動(dòng)生化儀測(cè)定膽堿酯酶（CHE）、鈣（Ca）的含量。神經(jīng)病靶酯酶（NTE）活性的測(cè)定采用經(jīng)典的酶抑制差異測(cè)定法。采用Western blotting檢測(cè)了大腦中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相關(guān)蛋白2和β-actin的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。 結(jié)果: 1．OPIDN

4、動(dòng)物模型的建立和病理觀察 本實(shí)驗(yàn)中甲胺磷組經(jīng)口小劑量（10mg/kg）多次累計(jì)染毒至5倍LD50以上，60％可出現(xiàn)OPIDN的典型癥狀，染毒后急性癥狀表現(xiàn)重，但是不給予保護(hù)劑，仍可度過急性期。磷酸三甲苯酯造模組的動(dòng)物，染毒后急性癥狀輕，進(jìn)食尚可，連續(xù)7天給予原油1ml/（kg·d），停藥后7-10天全部出現(xiàn)典型的OPIDN。甲胺磷誘導(dǎo)的OPIDN母雞神經(jīng)組織在出現(xiàn)OPIDN癥狀21d時(shí)可見到軸漿內(nèi)結(jié)構(gòu)融解現(xiàn)象，髓鞘成氣泡樣變，髓

5、鞘的損傷變化隨時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸加重，28d時(shí)可見多處板層松散、破裂甚至崩解。同時(shí)觀察到磷酸三甲苯酯誘導(dǎo)的OPIDN母雞神經(jīng)組織也呈現(xiàn)類似改變，這些變化也與臨床表現(xiàn)相一致。 2．動(dòng)物血清中生化指標(biāo)的測(cè)定 甲胺磷組動(dòng)物血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量在染毒結(jié)束后的7d、14d、21d均顯著高于對(duì)照組（P<0．05），磷酸三甲苯酯組在染毒結(jié)束后的7d和14d均顯著高于對(duì)照組（P<0．01）。磷酸三甲苯酯組動(dòng)物血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AS

6、T）的含量在染毒結(jié)束后的14d至28d均顯著高于對(duì)照組（P<0．05）。甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動(dòng)物血清膽堿酯酶（CHE）的含量在7d、14d、21d和28d均顯著低于對(duì)照組（P<0．05）。甲胺磷組動(dòng)物血清鈣的含量在染毒結(jié)束后的21d、28d均顯著高于對(duì)照組（P<0．05），磷酸三甲苯酯組在染毒結(jié)束后的7d顯著高于對(duì)照組P<0．05）。 3．神經(jīng)病靶酯酶（NTE）活性的測(cè)定 甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動(dòng)物神經(jīng)病靶酯酶（N

7、TE）的活性在染毒結(jié)束后的7d、14d、21d、28d均顯著低于對(duì)照組（P<0．01）。 4．OPIDN動(dòng)物大腦中蛋白激酶、β-actin、微管相關(guān)蛋白2含量的變化 甲胺磷組動(dòng)物大腦中蛋白激酶C（PKC）含量在染毒結(jié)束后的7d、14d、21d、28d分別降低了24％（P<0．05）、28％（P<0．05）、30％（P<0．05）、62％（P<0．01），磷酸三甲苯酯組在染毒結(jié)束后的7d、14d、21d、28d分別降低了6

8、4％（P<0．01）、58％（P<0．01）、58％（P<0．01）、43％（P<0．05）。甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動(dòng)物大腦中蛋白激酶A（PKA）的含量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。與對(duì)照組相比，甲胺磷組動(dòng)物大腦中β-actin含量在染毒結(jié)束后的14d升高了30％（P<0．05），磷酸三甲苯酯組的動(dòng)物在染毒后的第7d降低了26％（P<0．01）。甲胺磷組動(dòng)物大腦中微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）含量在染毒結(jié)束后的14d、2

9、8d均顯著高于對(duì)照組（P<0．01），磷酸三甲苯酯組在染毒結(jié)束后的7d、14d、21d均顯著高于對(duì)照組（P<0．01）。 結(jié)論: 1．工業(yè)用磷酸三甲苯酯可建立雞遲發(fā)性神經(jīng)?。∣PIDN）的良好動(dòng)物模型，甲胺磷經(jīng)口小劑量多次染毒可建立OPIDN動(dòng)物模型，在未給予保護(hù)劑的情況下，造模的成功率較以往有很大提高。兩組動(dòng)物的神經(jīng)組織均出現(xiàn)脫髓鞘等明顯的神經(jīng)損害。 2．OPIDN發(fā)生并進(jìn)展時(shí)，鈣離子含量的顯著改變，提示鈣離子

10、的含量變化與OPIDN的發(fā)生有相關(guān)關(guān)系。 3．沿用經(jīng)典的方法對(duì)NTE的抑制進(jìn)行監(jiān)測(cè)，NTE在OPIDN進(jìn)展中被明顯抑制，但其檢測(cè)還存在底物穩(wěn)定性不佳等局限性。 4．Western blotting方法在大腦未發(fā)現(xiàn)PKA含量的改變，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)對(duì)其他的神經(jīng)組織進(jìn)行進(jìn)一步的研究。PKC含量的降低出現(xiàn)在OPIDN的進(jìn)行階段，可以考慮其是否可作為OPIDN發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物。甲胺磷和磷酸三甲苯酯對(duì)蛋白的影響表現(xiàn)有差異性，