細胞信號轉導與有機磷遲發(fā)性神經(jīng)病變的關系研究.pdf

1、目的: 分別以甲胺磷和磷酸三甲苯酯誘發(fā)母雞遲發(fā)性神經(jīng)病（OPIDN），觀察病理學改變及超微結構的變化，測定神經(jīng)病靶酯酶的改變及有關生化指標的變化，檢測大腦信號轉導途徑中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相關蛋白2和β-actin的動態(tài)變化趨勢，闡明甲胺磷和磷酸三甲苯酯誘發(fā)OPIDN過程中不同信號蛋白含量水平的改變，為進一步探討細胞信號轉導途徑在OPIDN發(fā)生中的作用機制提供依據(jù)。 方法: 健康成年母雞（魯禽種雞）44

2、只，適應性喂養(yǎng)1周后，將動物按體重隨機分為甲胺磷造模組（n=20），磷酸三甲苯酯造模組（n=20）和對照組（n=4）。甲胺磷造模組經(jīng)口給予甲胺磷10mg/（kg·d），連續(xù)給藥14天；磷酸三甲苯酯造模組經(jīng)口給予磷酸三甲苯酯原油1ml/（kg·d），連續(xù)給藥7天，誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)毒性。對照組動物連續(xù)14天經(jīng)口給予生理鹽水1ml/（kg·d）。甲胺磷組、磷酸三甲苯酯組和對照組母雞于染毒后7d、14d、21d、28d斷頭處死，取血清備用。迅速取

3、出腦、脊髓、坐骨神經(jīng)和腓腸肌，按照常規(guī)要求制備病理及電鏡標本。動物血清中的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量采用試劑盒進行測定，采用自動生化儀測定膽堿酯酶（CHE）、鈣（Ca）的含量。神經(jīng)病靶酯酶（NTE）活性的測定采用經(jīng)典的酶抑制差異測定法。采用Western blotting檢測了大腦中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相關蛋白2和β-actin的動態(tài)變化趨勢。 結果: 1．OPIDN

4、動物模型的建立和病理觀察 本實驗中甲胺磷組經(jīng)口小劑量（10mg/kg）多次累計染毒至5倍LD50以上，60％可出現(xiàn)OPIDN的典型癥狀，染毒后急性癥狀表現(xiàn)重，但是不給予保護劑，仍可度過急性期。磷酸三甲苯酯造模組的動物，染毒后急性癥狀輕，進食尚可，連續(xù)7天給予原油1ml/（kg·d），停藥后7-10天全部出現(xiàn)典型的OPIDN。甲胺磷誘導的OPIDN母雞神經(jīng)組織在出現(xiàn)OPIDN癥狀21d時可見到軸漿內(nèi)結構融解現(xiàn)象，髓鞘成氣泡樣變，髓

5、鞘的損傷變化隨時間的延長也逐漸加重，28d時可見多處板層松散、破裂甚至崩解。同時觀察到磷酸三甲苯酯誘導的OPIDN母雞神經(jīng)組織也呈現(xiàn)類似改變，這些變化也與臨床表現(xiàn)相一致。 2．動物血清中生化指標的測定 甲胺磷組動物血清谷丙轉氨酶（ALT）的含量在染毒結束后的7d、14d、21d均顯著高于對照組（P<0．05），磷酸三甲苯酯組在染毒結束后的7d和14d均顯著高于對照組（P<0．01）。磷酸三甲苯酯組動物血清谷草轉氨酶（AS

6、T）的含量在染毒結束后的14d至28d均顯著高于對照組（P<0．05）。甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動物血清膽堿酯酶（CHE）的含量在7d、14d、21d和28d均顯著低于對照組（P<0．05）。甲胺磷組動物血清鈣的含量在染毒結束后的21d、28d均顯著高于對照組（P<0．05），磷酸三甲苯酯組在染毒結束后的7d顯著高于對照組P<0．05）。 3．神經(jīng)病靶酯酶（NTE）活性的測定 甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動物神經(jīng)病靶酯酶（N

7、TE）的活性在染毒結束后的7d、14d、21d、28d均顯著低于對照組（P<0．01）。 4．OPIDN動物大腦中蛋白激酶、β-actin、微管相關蛋白2含量的變化 甲胺磷組動物大腦中蛋白激酶C（PKC）含量在染毒結束后的7d、14d、21d、28d分別降低了24％（P<0．05）、28％（P<0．05）、30％（P<0．05）、62％（P<0．01），磷酸三甲苯酯組在染毒結束后的7d、14d、21d、28d分別降低了6

8、4％（P<0．01）、58％（P<0．01）、58％（P<0．01）、43％（P<0．05）。甲胺磷組和磷酸三甲苯酯組動物大腦中蛋白激酶A（PKA）的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0．05）。與對照組相比，甲胺磷組動物大腦中β-actin含量在染毒結束后的14d升高了30％（P<0．05），磷酸三甲苯酯組的動物在染毒后的第7d降低了26％（P<0．01）。甲胺磷組動物大腦中微管相關蛋白2（MAP-2）含量在染毒結束后的14d、2

9、8d均顯著高于對照組（P<0．01），磷酸三甲苯酯組在染毒結束后的7d、14d、21d均顯著高于對照組（P<0．01）。 結論: 1．工業(yè)用磷酸三甲苯酯可建立雞遲發(fā)性神經(jīng)?。∣PIDN）的良好動物模型，甲胺磷經(jīng)口小劑量多次染毒可建立OPIDN動物模型，在未給予保護劑的情況下，造模的成功率較以往有很大提高。兩組動物的神經(jīng)組織均出現(xiàn)脫髓鞘等明顯的神經(jīng)損害。 2．OPIDN發(fā)生并進展時，鈣離子含量的顯著改變，提示鈣離子

10、的含量變化與OPIDN的發(fā)生有相關關系。 3．沿用經(jīng)典的方法對NTE的抑制進行監(jiān)測，NTE在OPIDN進展中被明顯抑制，但其檢測還存在底物穩(wěn)定性不佳等局限性。 4．Western blotting方法在大腦未發(fā)現(xiàn)PKA含量的改變，在今后的試驗中應當對其他的神經(jīng)組織進行進一步的研究。PKC含量的降低出現(xiàn)在OPIDN的進行階段，可以考慮其是否可作為OPIDN發(fā)生發(fā)展的生物標志物。甲胺磷和磷酸三甲苯酯對蛋白的影響表現(xiàn)有差異性，