人食管癌光動(dòng)力效應(yīng)影響因素及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是利用激光的光化學(xué)原理，通過(guò)特定波長(zhǎng)的激光激活腫瘤組織內(nèi)滯留的光敏劑，與腫瘤組織內(nèi)的氧發(fā)生作用，產(chǎn)生一些活性氧分子(radical oxygen species，ROS)，并通過(guò)氧化作用攻擊細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)的氧化損傷，當(dāng)氧化損傷的積累超過(guò)一定的閾值時(shí)，細(xì)胞便開(kāi)始死亡。另外，還可造成腫瘤微血管急性損傷。與常規(guī)的手術(shù)、化療等療法相比，PDT具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)創(chuàng)傷??；

2、(2)毒性??；(3)選擇性好；(4)適用性好；(5)重復(fù)性好；(6)可姑息治療；(7)可消滅隱性病灶；(8)可保護(hù)容貌及重要器官。目前已開(kāi)始應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，日漸成為腫瘤治療新手段。 食管癌是人類常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，而我國(guó)是高發(fā)國(guó)家。隨著新型光敏劑的發(fā)展及半導(dǎo)體激光發(fā)生系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，PDT在食管癌尤其是早期食管癌及癌前病變的治療上已取得較大進(jìn)展。但臨床治療中發(fā)現(xiàn)，腫瘤光動(dòng)力治療療效不穩(wěn)定是非常常見(jiàn)的問(wèn)題。同樣是食管癌有的

3、患者光動(dòng)力治療后可以達(dá)到臨床治愈的水平，而有的卻療效不佳。究其原因可能是腫瘤組織中氧含量、光敏劑濃度的不同以及腫瘤組織對(duì)光敏劑敏感程度不同所致。因此本實(shí)驗(yàn)以第一代光敏劑血卟啉衍生物(Hematoporphyrin derivative，HPD)及Photofrin在特定光源下作用于人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109，以初步探討HPD、Photofrin兩者光敏劑不同孵育濃度、孵育時(shí)間及不同光照能量密度等因素對(duì)其體外PDT效應(yīng)的影響。同時(shí)建立人

4、食管癌裸鼠模型，給予行HPD-PDT、Photofrin-PDT、5-ALA-PDT后觀察治療組與對(duì)照組治療前后瘤組織體積、腫瘤表面皮膚變化及瘤組織HE染色情況，并監(jiān)測(cè)PDT后第3天腫瘤組織中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、survivin、caspase-3蛋白表達(dá)情況，以初步探討人食管癌荷瘤裸鼠PDT效應(yīng)主要影響因素及作用機(jī)制。 第一部分人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109體外光動(dòng)力效應(yīng)主要影響因素的研究

5、 研究方法及內(nèi)容 1、HPD-PDT對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109生長(zhǎng)曲線的影響：通過(guò)MTT法監(jiān)測(cè)不同HPD孵育濃度對(duì)Eca．109細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并將酶標(biāo)儀Bio-Rad550測(cè)得的OD值繪制不同孵育濃度下Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 2、Eca-109的體外光動(dòng)力效應(yīng)：以兩種光敏劑HPD和Photofrin不同孵育濃度(0ug/ml，0.1ug/ml，0.75ug/ml，1.5ug/ml，3.0ug/ml，6.

6、0ug/ml，10.0ug/ml，20.0ug/ml)和不同孵育時(shí)間(分別孵育4h、6h、12h、24h)于飽和光照能量密度(20J/cm<'2>)下以及不同孵育濃度(Photofrin孵育濃度為：0ug/ml，0.05ug/ml，0.375ug/ml，0.75ug/ml，1.5ug/ml，3.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml，HPD孵育濃度為：0ug/ml，0.1ug/ml，0.75ug/ml，1.5ug/ml，3.

7、0ug/ml，6.0ug/ml，10.0ug/ml，20.0ug/ml)于三種不同光能量密度(10 J/cm<'2>，30J/cm<'2>，50 J/cm<'2>)下作用于人食管癌細(xì)胞Eca-109，光源采用DIOMED630PDT系統(tǒng)，光照后避光孵育24小時(shí)，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)方法采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，細(xì)胞生存率與濃度間的關(guān)系采用曲線擬合。

8、 3、熒光分光光度法檢測(cè)胞內(nèi)實(shí)際HPD濃度：給予不同濃度HPD(孵育濃度為：1.5ug/ml，3.0ug/ml，6.0ug/ml，10.0ug/ml)孵育Eca-109細(xì)胞4小時(shí)后，去培養(yǎng)液，加入去離子水反復(fù)凍融后取上清于熒光分光光度計(jì)RT-5000檢測(cè)胞內(nèi)光敏劑熒光值。HPD標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取純細(xì)胞凍存液，加入HPD使其終濃度分別為0ug/ml，0.008ug/ml，0.016ug/ml，0.064ug/ml，0.128ug/ml，0

9、.150ug/ml，于熒光分光光度計(jì)RT-5000檢測(cè)熒光值，并依據(jù)測(cè)得的熒光值與HPD濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件同上，光敏劑孵育濃度與胞內(nèi)實(shí)際光敏劑濃度間的相關(guān)性采用線性回歸分析。 二、主要結(jié)果1、從繪制的OD值曲線可見(jiàn)，隨著HPD孵育濃度的增高，其OD值呈下降趨勢(shì)，表明濃度越高，其細(xì)胞存活越少，即HPD-PDT對(duì)其細(xì)胞生長(zhǎng)影響越大。但當(dāng)濃度由10ug/ml增至20ug/ml時(shí)其OD值未見(jiàn)明顯下降。 2、Phot

10、ofrin、HPD兩者三種不同光照能量密度及不同濃度下其生存率間均有明顯差異，且二者之間存在顯著的交互效應(yīng)，P值均<0.01。同一光照能量密度下兩者不同孵育濃度間的生存率均有顯著差異，P值均時(shí)其生

11、存率最低，而當(dāng)其濃度由5.0ug/ml增至10ug/ml時(shí)，光照能量密度由10J/m<'2>增加至50 J/m<'2>時(shí)不能提高殺傷效應(yīng)。當(dāng)HPD濃度為20ug/ml，光照能量密度為30J/cm<'2>時(shí)其殺傷效應(yīng)最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為6ug/ml至20ug/ml時(shí)，光照能量密度由30J/cm<'2>增加至50J/cm<'2>時(shí)不能提高殺傷效應(yīng)。 3、Photofrin、HPD四中不同孵育時(shí)間和不同孵育濃度下生存率間均有顯著差異，且二

12、者之間存在顯著的交互效應(yīng)，P值均<0.01。 4、孵育4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)下不同濃度Photofrin與細(xì)胞生存率間的擬合曲線方程分別為Y=1.042-0.241X+0.058X<'2>-0.005X<'3>，Y=1.120-0.305X+0.054X<'2>-0.003X<'3>，Y=0.837+0.017X+0.034X<'2>+0.003X<'3>，Y=0.920-0.019X-0.041X<'2>+0.00

13、4X<'3>，并依據(jù)擬合曲線方程分別求得其半數(shù)殺傷濃度。 5、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.86X-0.083，相關(guān)系數(shù)R=-0.963，F(xiàn)=50.482，P=0.002。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)得的胞內(nèi)光敏劑熒光值求得胞內(nèi)光敏劑濃度，與孵育濃度作相關(guān)回歸分析，得回歸方程Y=12.521+0.001X，相關(guān)系數(shù)R=0.998，F(xiàn)=451.724，P=0.002。因此，胞內(nèi)光敏劑的實(shí)際濃度與孵育濃度呈正相關(guān)。從上述HPD孵育Eca-109細(xì)胞

14、4小時(shí)后行MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，隨著相應(yīng)孵育濃度增加，其生存率降低，即殺傷效應(yīng)越強(qiáng)，而孵育濃度和胞內(nèi)濃度呈正相關(guān)，從而進(jìn)一步說(shuō)明其體外光動(dòng)力效應(yīng)隨著孵育濃度增加而呈增強(qiáng)趨勢(shì)主要是由于進(jìn)入胞內(nèi)光敏劑濃度的增加。 三、主要結(jié)論 1、隨著孵育HPD濃度的增加，其HPD-PDT對(duì)Eca-109抑制或殺傷作用越明顯，但濃度由10ug/ml增加為20ug/ml時(shí)，其殺傷或抑制效應(yīng)無(wú)明顯增強(qiáng)，即達(dá)到平臺(tái)期。 2、Eca-109細(xì)

15、胞體外PDT效應(yīng)最佳殺傷效應(yīng)的光照能量密度和孵育濃度點(diǎn)為：Photofrin孵育濃度為10ug/ml，光照能量密度為10 J/cm<'2>；HPD濃度為20ug/ml，光照能量密度為30 J/cm<'2>；最佳殺傷效應(yīng)的孵育時(shí)間和孵育濃度點(diǎn)：Photofrin孵育濃度為10.0ug/ml，孵育時(shí)間為24小時(shí)；HPD孵育濃度為10ug/ml，孵育時(shí)間為12小時(shí)。 第二部分 HPD-PDT、Photofrin-PDT、5-ALA-P

16、DT抑制人食管鱗癌荷瘤裸鼠效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究 一、研究方法及內(nèi)容 建立人食管鱗癌裸鼠腫瘤模型，每3天監(jiān)測(cè)腫瘤瘤徑，待腫瘤大小為150～300mm<'3>時(shí)，開(kāi)始給予行光動(dòng)力治療。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和光動(dòng)力治療組，對(duì)照組包括完全空白對(duì)照組(不作任何處理)和單純光照組(只給予光照)。光動(dòng)力治療組按給予光敏劑不同分為HPD組，Photofrin組、5-ALA組。每組7只。HPD組按30mg/Kg，Photofrin組按10mg/Kg，5

17、-ALA組按100mg/Kg腹腔給藥，HPD組及5-ALA組于給藥后4小時(shí)，Photofrin組則給藥24小時(shí)后開(kāi)始進(jìn)行光動(dòng)力治療。光源采用DIOMED630 PDT系統(tǒng)，按120J/cm<'2>光能量密度進(jìn)行光照，光照后監(jiān)測(cè)腫瘤體積及觀察腫瘤表明皮膚的變化，并于治療后第3天(每組3只)，21天(每組4只)分別處死部分裸鼠，取瘤組織進(jìn)行MDA，HE染色，survivin、caspase-3蛋白組化的檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS13.0，