雙胎胎盤人白細胞抗原-G第8外顯子多態(tài)性、蛋白表達與妊娠結(jié)局相關(guān)性的研究.pdf

1、雙胎妊娠與單胎妊娠比較，不良妊娠結(jié)局發(fā)生率明顯增高。約83％的雙胎妊娠合并有一種以上的妊娠并發(fā)癥。 無論是單胎抑或雙胎妊娠，成功妊娠的維持與母胎間正常的免疫耐受密切相關(guān)。在妊娠期間，胎兒能在母體宮腔內(nèi)順利發(fā)育而不被排斥，目前已闡明其主要原因是滋養(yǎng)細胞不表達經(jīng)典的主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類分子，只表達非經(jīng)典的MHC Ⅰ類分子：人白細胞抗原G(HLA-G)等。HLA-G維持妊娠的機理包括：(1)直接或間接抑制自然殺傷

2、(NK)細胞；(2)與蛻膜組織中的T細胞結(jié)合，抑制T細胞殺傷；(3)調(diào)節(jié)T輔助性細胞因子分泌，促使Th2偏移。(4)可溶性HLA-G分子通過激活Fas/FasL旁路，引起活化母體CD8<'->T細胞的凋亡。 研究HLA-G基因多態(tài)性是探討HLA-G分子功能的重要途徑。通過對基因多態(tài)性的研究可以為疾病的預測和診斷提供依據(jù)。綜合文獻，關(guān)于單胎HLA-G外顯子2、3、4等編碼的基因多態(tài)性和妊娠結(jié)局的研究中，結(jié)論存在不一致，有認為HLA

3、-G的表達和基因多態(tài)性關(guān)系不大，也有認為HLA-G的基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)、子癇前期及胎兒發(fā)育遲緩等密切相關(guān)。而近年發(fā)現(xiàn)HLA-G的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’UTR)第8外顯子中的14bp缺失/插入位點(14-bp/14+bp)多態(tài)性與妊娠維持的關(guān)系密切，成為關(guān)注熱點。國外在對單胎妊娠的研究中證實HLA-G第8外顯子基因多態(tài)性可能影響HLA-G轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，與不良妊娠結(jié)局(包括流產(chǎn)、子癇前期、胎盤早剝、胎兒發(fā)育受限等)有顯著性關(guān)聯(lián)。國內(nèi)研究未見

4、關(guān)于HLA-G第8外顯子多態(tài)性的研究報道。 雙胎妊娠屬高危妊娠，其妊娠期的免疫耐受狀況目前尚不清楚，但早在上世紀七十年代，就有學者提出雙胎妊娠較單胎妊娠攜帶的組織相容性抗原量明顯增高，推測這種特殊的胎兒抗原超負荷對妊娠結(jié)局有一定的影響。有文獻提示雙胎妊娠較單胎妊娠免疫呈Th2偏移。關(guān)于基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)雙胎妊娠胎兒某些基因的多態(tài)性對妊娠結(jié)局可產(chǎn)生影響，如胎兒攜帶IL-1拮抗受體第2等位基因(ILlRN*2)的頻數(shù)與雙胎發(fā)生胎

5、膜早破相關(guān)，且顯著增加圍產(chǎn)兒死亡率。若第一胎胎兒Fas基因啟動子出現(xiàn)第670位的A→G的單核苷酸突變(TNFRSF6)，則雙胎發(fā)生未足月胎膜早破(PPROM)的機率顯著性增高。 本研究擬將雙胎HLA-G外顯子8(14-bp/14+bp)多態(tài)性與妊娠結(jié)局的關(guān)系作為研究課題，并探討胎盤HLA-G外顯子8基因多態(tài)性和HLA-G表達量的差異，從基因、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平和臨床結(jié)局系統(tǒng)研究HLA-G在雙胎妊娠的表達狀態(tài)，并通過對母體

6、外周血sHLA-G的檢測分析其與雙胎HLA-G基因表達關(guān)系，探討臨床應用價值。了解雙胎妊娠中的母胎耐受機制，以期對改善雙胎預后和提高輔助生育技術(shù)的成功率及安全性提供參考資料。 第一章：雙胎胎盤HLA-G第8外顯子基因多態(tài)性 本研究共收集雙胎病例125例，并取同期分娩正常單胎44例作為對照。采用多聚酶鏈反應一序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測雙胎胎盤該位點的多態(tài)性，并通過基因測序證實。探討雙胎HLA-G第8外顯子基因

7、多態(tài)性分布，與正常單胎進行比較，探討HLA-G在雙胎妊娠維持上所起的作用。 結(jié)果提示： 1．正常單胎和雙胎妊娠胎盤第8外顯子14+bp、14-bp等位基因及各基因型頻率總體分布差異無顯著性(P＞0.05)。雙胎妊娠總14+bp基因頻率為308％，高于單胎妊娠27.3％，雙胎妊娠中14+bp/14+bp基因型比例10.8％，高于單胎 4.5％，但無顯著性差異(P>0.05)。 2．雙胎妊娠兩個胎盤

8、基因組合均為14+bp／14+bp分娩孕周顯著(31.5±6.1周)低于其他基因組合型(P<0.05)。 3．自然受孕雙胎及單絨毛膜雙胎兩胎間HLA-G基因多態(tài)性一致性高，但在不同一性雙胎分布無顯著性差異。自然受孕組以兩胎均為14-bp／14+bp雜合子組合最多(40.7％)，輔助生育組以兩胎均為14-bp／14-bp組合最多(37.9％)。 4．單絨毛膜雙胎中有兩例胎兒基因型不一致，均為自然受孕。

9、5．兩胎14+bp等位基因總頻數(shù)大小在雙胎合并子癇前期病例中有顯著性差異，經(jīng)檢驗證實子癇前期發(fā)生與兩胎14+bp等位基因有關(guān)(P<0.05)。 6．14+bp／14+bp基因型圍產(chǎn)兒體重顯著低于其他兩種14bp多態(tài)性基因型(P<0.05)。 7．基因型與圍產(chǎn)兒性別可能相關(guān)，男性圍產(chǎn)兒14-bp／14-bp基因組頻率較高(47.5％比32.8％，95％可信區(qū)間為0.56l～0.571)。 第二章：胎盤HLA

10、-G mRNA的表達 第一章研究已證實胎盤HLA-G第8外顯子多態(tài)性可能影響雙胎妊娠的妊娠結(jié)局。而HLA-G第8外顯子3’UTR區(qū)含有決定mRNA分布、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性及控制mRNA轉(zhuǎn)錄起始的信號，因此14bp多態(tài)性與HLA-GmRNA的選擇性剪接以及蛋白合成可能密切相關(guān)。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測HLA-GmRNA在胎盤的表達量，探討不同基因型HLA-G的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異。 結(jié)果： 1

11、．雙胎胎盤3種14bp多態(tài)性基因型中，14+bp／14+bp基因型mRNA表達量明顯下降(P<0.05)，而14-bp／14-bp與14-bp／14+bp兩種基因型表達量無顯著性差異。 2．相同基因型的單胎妊娠與雙胎妊娠轉(zhuǎn)錄表達量無顯著性差異。 第三章：胎盤HLA-G蛋白的表達 本研究通過免疫組化和Western Blot方法檢測HLA-G蛋白在胎盤上表達的定位和表達量，探討HLA-G蛋白表達與雙胎胎兒第8外顯

12、子基因多態(tài)性的關(guān)系。 結(jié)果： 1．免疫組化檢測胎盤HLA-G蛋白，雙胎妊娠三組基因型比較，14+bp／14+bp組表達程度明顯低于其余兩組(P=-0.001)。 2．單胎妊娠組和雙胎妊娠相同基因型比較，其HLA-G蛋白表達均無顯著性差異(P>0.05)。 3．孕中晚期胎盤HLA-G蛋白特異性表達在絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞，陽性部位為胞漿和胞膜，絨毛細胞幾乎不表達。子癇前期胎盤HLA-G蛋白表

13、達顯著下降，且出現(xiàn)胎盤絨毛稀少、血管減少、部分血管管壁增厚等病理改變。雙胎妊娠PE組與非PE組14-bp／14-bp及14-bp／14+bp兩種基因型HLA-G蛋白表達陽性率均無顯著性差異(P>0.05)。PE組14+bp／14+bp基因型HLA-G蛋白表達R±SD<,R>值為(0.37±0.07)，非PEl4+bp／14+bp基因型組R±SD<,R>值為(0.63±0.10)，兩者差異有顯著性(P<0.05)。 4．We

14、stern B10t方法檢測HLA-G蛋白表達條帶，孕早期絨毛組織與孕晚期胎盤差別不明顯，主要異構(gòu)體均為HLA-G1／5。 5．Western Blot方法檢測雙胎妊娠胎盤三種基因型HLA-G蛋白(HLA-G1／5)表達，14+bp／14+bp組比較其他兩組，條帶灰度比值顯著性降低(P<0.05)。14-bp／14-bp與14-bp／14+bp組間比較差異無顯著性(P=0.550)。 第四章：雙胎妊娠母體外周血sHLA

15、-G檢測 本研究采用雙抗體夾心ELISA的方法，以期探討妊娠中晚期母體外周血可溶性HLA-G與胎兒HLA-G第8外顯子基因多態(tài)性之間的相互關(guān)系，以期了解其臨床檢測應用價值。 結(jié)果： 1．雙胎妊娠孕婦外周血sHLA-G(73.1±23.8)U／ml顯著高于單胎妊娠(37.8±27.0)U／ml(P<0.01)。 2．雙胎妊娠母體外周血sHLA-G濃度與胎盤第8外顯子基因多態(tài)性無關(guān)，且與分娩孕周無顯

16、著性關(guān)系(P>0.05)。 3．合并子癇前期雙胎病例共16例，母體外周血sHLA-G濃度(60.9±27.7) U／ml，未合并子癇前期雙胎病例47例，母體外周血sHLA-G濃度為(69.5±18.8)U／ml，兩組比較差異無顯著性(P=0.52)。 結(jié)論 1．本研究中單胎妊娠與雙胎妊娠胎盤HLA-G第8外顯子多態(tài)性基因型頻率分布無顯著差異，中國南方人群HLA-G第8外顯子多態(tài)性基因型分布由多到

17、少依次為14-bp／14-bp、14-bp／14+bp及14+bp／14+bp。 2．孕中晚期胎盤存在HLA-G的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，HLA-G轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平與第8外顯子基因多態(tài)性有關(guān)，14+bp／14+bp基因型顯著降低HLA-G的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量。 3．雙胎妊娠和單胎妊娠HLA-G轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平無顯著性差異。 4．14+bp／14+bp基因型圍產(chǎn)兒出生體重明顯降低，但HLA-G第8外顯子基因多態(tài)