三鏈形成寡核苷酸對(duì)大鼠Sertoli細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活因子的反基因研究.pdf

1、第一章大鼠uPA基因特異三鏈寡核苷酸的設(shè)計(jì)
　　 第一節(jié)大鼠uPA基因生物信息學(xué)分析及啟動(dòng)子預(yù)測(cè)
　　 大鼠尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)與男(雄)性生殖調(diào)控具有密切關(guān)系(Liu，2007；明鈺& 熊承良，2006；王曉燕& 熊承良，2003)，而大鼠是常用的生育調(diào)節(jié)的動(dòng)物模型，所以對(duì)大鼠uPA基因和蛋白的研究頗有意義。大鼠uPA cDNA與其

2、它物種的uPA cDNA相似，與小鼠、人類、狒狒和豬分別有86、76、76和70[％]的相同序列。在編碼區(qū)的相似性最高，分別為91、88、83和76[％]，但在非編碼區(qū)有很大的差異。大鼠uPA cDNA有編碼432個(gè)氨基酸的一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，該蛋白的預(yù)測(cè)分子量為48KDa。與上述物種的uPA的氨基酸一致率為88、71、70和69[％]。如果忽略保守的氨基酸替代物，其一致性將更高，分別為98、93、93和84[％]。與人類和豬的uPA蛋

3、白不同，大鼠uPA沒(méi)有潛在的糖基化位點(diǎn)，但卻保留著生長(zhǎng)因子、kringle、以及所有物種uPA擁有的絲氨酸蛋白酶活性區(qū)域。由于反基因技術(shù)的應(yīng)用需要一段盡可能不間斷的多聚嘌呤/嘧啶靶序列做為干擾靶位點(diǎn)，而且這種序列多存在于基因啟動(dòng)子范圍內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位重疊并與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。但是對(duì)大鼠uPA基因目前尚缺乏系統(tǒng)的研究報(bào)道，我們對(duì)大鼠uPA基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析表明：在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游27 bp處有一個(gè)非經(jīng)典的TATA盒，但該區(qū)域具有典

4、型的GC盒和啟動(dòng)子區(qū)所常見(jiàn)的SP1和AP-1等結(jié)合區(qū)域，表明此區(qū)域?yàn)檎婧宿D(zhuǎn)錄的核心啟動(dòng)子所在區(qū)域。另外，在其核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，存在一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)的上游81 bp和一不典型的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的TATA盒子上游47 bp處含有25個(gè)堿基的嘌呤富集序列，此序列符合反基因技術(shù)的靶序列的要求。
　　 第二節(jié)三鏈形成寡核苷酸親和性測(cè)定
　　 在本節(jié)中，我們以一個(gè)含有多聚嘌呤/嘧啶的大鼠雙鏈uPA基因序列做為靶序列，采用[

5、γ-32P]ATP 末端標(biāo)記的嘧啶鏈和稍微過(guò)量的充足的嘌呤鏈與所設(shè)計(jì)的三鏈形成寡核苷酸進(jìn)行電泳遷移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)分析以測(cè)定其親和力(Kd)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，uPA 特異性的uPA-PO和uPA-PS 都形成了三鏈結(jié)構(gòu)，然而后者的親和性較前者差；uPA-PO和uPA-PS的Kd分別為10-7 M和10-6 M。
　　 第二章大鼠支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)與

6、鑒定
　　 原代支持細(xì)胞培養(yǎng)是研究精子發(fā)生的有力手段，是研究精子發(fā)生以及此過(guò)程中支持-支持細(xì)胞和支持-生精細(xì)胞間相互作用的基礎(chǔ)。在本試驗(yàn)中，在前人工作的基礎(chǔ)上，采用復(fù)合酶消化、低滲處理的方法進(jìn)行了支持細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，并運(yùn)用多種方法對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行鑒定。我們建立了穩(wěn)定的支持細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，可達(dá)到95[％]的純度，可以很好地應(yīng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第三章TFOs 對(duì)大鼠支持細(xì)胞uPA基因的降調(diào)節(jié)
　　 第一

7、節(jié)大鼠uPA實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物設(shè)計(jì)和方法建立
　　 為設(shè)計(jì)大鼠尿激酶SYBR Green I實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)的引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測(cè)方法。我們通過(guò)基因庫(kù)獲取靶基因序列，收集分析相關(guān)生物信息數(shù)據(jù)，應(yīng)用Oligo 6.22設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：提取體外培養(yǎng)大鼠睪丸總RNA反轉(zhuǎn)錄后運(yùn)用進(jìn)行擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，10倍倍比稀釋后做標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、相關(guān)系數(shù)和熔解曲線分析進(jìn)行條件優(yōu)化并進(jìn)行可重復(fù)

8、性檢測(cè)。設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度為21bp；GC含量52.4[％]；上下游引物3'最穩(wěn)定二聚體和及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量分別為-1.5、-0.40 kcal/mol和-3.5、-0.90 kcal/mol，引物間最穩(wěn)定二聚體為-3.1 kcal/mol。引物間Tm值和引物與產(chǎn)物Tm差值分別0.3℃和4.9℃；引發(fā)效率分別455和403。優(yōu)化后的25 μl反應(yīng)體系中各組分終濃度為：dNTP200μmol，Taq DNA聚合酶0.05U/μl，引物200nm

9、ol，Mgcl2 3mmol，SYBR GreenI 0.2×，cDNA 2μl(20ng)。反應(yīng)條件為：95 5min ℃預(yù)變性；95 30s ℃變性，58 ℃20s退火，72 25s ℃延伸，82 5s ℃采集熒光，38個(gè)循環(huán)，該體系具有101.0～108.7[％](斜率-3.299～-3.13)的擴(kuò)增效率，線形相關(guān)系數(shù)范圍0.996～0.999。可重復(fù)性檢測(cè)中，三種不同濃度樣本的批內(nèi)變異和批間變異分別為0.05[％]，0.02[％

10、]，1.7[％]和1.78[％]，2.29[％]，3.54[％]。該引物能夠特異地實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的檢測(cè)，優(yōu)化建立的SYBRGreen I 實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、線性檢測(cè)范圍廣的特點(diǎn)，適于對(duì)大鼠尿激酶基因表達(dá)水平的檢測(cè)。
　　 第二節(jié)TFOs 對(duì)內(nèi)源性u(píng)PA基因表達(dá)的降調(diào)節(jié)
　　 在睪丸，尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，u

11、PA)由支持細(xì)胞產(chǎn)生，它與血睪屏障(blood-testis-barrier，BTB)密切相關(guān)，被認(rèn)為是潛在的避孕靶點(diǎn)。本研究中，應(yīng)用三鏈形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，TFOs)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠支持細(xì)胞中的uPA的表達(dá)調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行研究。支持細(xì)胞在330nM的TFOs作用下，uPA在mRNA和蛋白活性都有顯著性地下降。而做為纖溶酶原激活因子的另一形式的tPA在一定程度的升高，彌補(bǔ)了總的Pas活性