東海原甲藻和米氏凱倫藻對氮、磷限制的分子響應(yīng)機制研究.pdf

1、本研究以東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和米氏凱倫（Karenia mikimotoi Hansen）為對象，采用高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)、熒光定量PCR和生理生化等多種研究手段，揭示東海原甲藻在氮、磷限制條件下的氮磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機制，以及相較于氮磷飽和條件下，在磷限制條件下進(jìn)行不同形態(tài)磷源恢復(fù)時，東海原甲藻氮、磷代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)豐度和差異，并闡明米氏凱倫藻在氮磷飽和條件下的氮、磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機制

2、，從而為探討磷營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變對浮游植物種間競爭的影響和開展海洋赤潮藻類對不同磷源利用特征的研究提供一定的分子理論依據(jù)。
　　采用RNA-seq技術(shù)鑒定不同條件下東海原甲藻基因的表達(dá)差異，并獲取飽和條件下米氏凱倫藻的轉(zhuǎn)錄本基因庫及構(gòu)建米氏凱倫藻氮磷轉(zhuǎn)運和同化利用假定模型。通過熒光定量PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果，并分析東海原甲藻在磷限制條件下進(jìn)行不同形態(tài)磷源恢復(fù)時，氮、磷代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)豐度和差異；最后通過生物信息學(xué)分析，并結(jié)

3、合細(xì)胞密度計數(shù)、光合作用效率測定和磷營養(yǎng)鹽測定等探索東海原甲藻的氮磷代謝途徑，構(gòu)建東海原甲藻氮磷轉(zhuǎn)運和同化利用假定模型。
　　氮限制12h條件下，通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)了東海原甲藻差異表達(dá)基因，其中有34個基因上調(diào)、31個基因下調(diào)；磷限制12h條件下，也發(fā)現(xiàn)了東海原甲藻差異表達(dá)基因，其中有224個基因上調(diào)、507個基因下調(diào)。熒光定量PCR證實了高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異表達(dá)結(jié)果的可靠性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺磷處理后，RNA轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化、光合作

4、用、胞吞作用、嘧啶代謝、糖酵解/糖異生作用、氨基酸生物合成代謝、維生素消化吸收、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工過程等相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)，而核糖體蛋白代謝途徑的基因的表達(dá)顯著上調(diào)；缺氮處理后，RNA轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化、光合作用、胞吞作用、嘧啶代謝、氨基酸生物合成代謝、煙酸鹽和尼克酰胺代謝、維生素消化吸收、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工過程等相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)，而核糖體蛋白代謝途徑的基因的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)合高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因注釋和KEGG分析，構(gòu)建了東海

5、原甲藻和米氏凱倫藻氮磷轉(zhuǎn)運和同化利用假定模型，較詳盡地呈現(xiàn)了氮、磷代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機制。
　　研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻、米氏凱倫藻細(xì)胞膜上除存在幾種常見的轉(zhuǎn)運蛋白基因外，還存在直接吸收大分子有機物的轉(zhuǎn)運蛋白基因，為聚胺轉(zhuǎn)座子（PUT。Polyamine transporter）、寡肽轉(zhuǎn)座子（PepT，Oligopeptide transporter）；此外，東海原甲藻細(xì)胞膜上還存在核苷轉(zhuǎn)座子（ENT，Nucleoside transpo

6、rter），而米氏凱倫藻則擁有4種類型的脲酶輔助蛋白UreD/F/G/H，這些都使得東海原甲藻、米氏凱倫藻在利用可溶性有機氮、浮游植物種間競爭和群落演替方面較其他浮游植物種類占有較大優(yōu)勢，這可能是國內(nèi)相應(yīng)海域頻繁爆發(fā)東海原甲藻和米氏凱倫藻赤潮災(zāi)害的原因之一。
　　此外，東海原甲藻、米氏凱倫藻細(xì)胞膜上除存在常見的無機磷酸鹽轉(zhuǎn)座子（Inorganic phosphate transporter）外，還存在無機二磷酸酶/氫轉(zhuǎn)移焦磷酸酶（

7、inorganic diphosphatase/hydrogen-translocating pyrophosphatase）基因、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)座子（ABC transporter）、能直接吸收大分子溶解態(tài)有機磷的磷脂轉(zhuǎn)座子（Phospholipid transporter）和有機膦酸酯跨膜轉(zhuǎn)運 ATP酶基因（organic phosphonate transmembrane-transporting ATPase）。此外，東海原甲藻

8、細(xì)胞膜上還存在直接吸收小分子溶解態(tài)有機磷的戊糖磷酸轉(zhuǎn)座子（Triose-phosphate transporter）基因。兩種藻均含有堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase），只不過東海原甲藻的堿性磷酸酶基因位于細(xì)胞膜上，而米氏凱倫藻則位于細(xì)胞外基質(zhì)中，且兩種藻都為混合營養(yǎng)型甲藻。
　　研究表明，自然海域中與小分子有機磷（焦磷酸、ATP）和大分子有機磷（磷脂、有機膦酸酯）結(jié)構(gòu)相似的溶解有機磷在一定程度上也可以為東海原