增殖細胞核抗原基因作為東海原甲藻生長指標的現(xiàn)場實驗研究.pdf

1、對浮游藻現(xiàn)場生長率等基本生理生態(tài)學參數(shù)的測定，是估算浮游藻類生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動力學模型乃至赤潮預測的基礎。在實驗室之前的研究工作中發(fā)現(xiàn)，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)基因相對表達量可以作為指示其生長率變化的良好指標，并建立了中肋骨條藻和東海原甲藻PCNA基因相對表達量與其現(xiàn)場生長率之間的定量關(guān)系。為這兩種赤潮的監(jiān)測和預報研究奠定了基礎。
　　

2、本研究在之前研究的基礎上，著力于將該方法應用到對現(xiàn)場樣品進行生長率的測定。分別從現(xiàn)場樣品的采集方式、RNA提取方法、內(nèi)參基因引物的特異性、定量PCR反應體系的優(yōu)化等幾個方面進行了實驗。在對舟山外海東海原甲藻赤潮區(qū)的生長率現(xiàn)場測定中，對建立的PCNA相對表達量法進行了驗證并應用于現(xiàn)場，為將該方法用于對赤潮的快速監(jiān)測奠定了基礎。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)從樣品量、研磨方法、濾膜規(guī)格和提取試劑四個方面對RNA提取

3、效率的影響進行條件優(yōu)化實驗。確定了最小樣品量為2×106個細胞；在進行過濾時可選用孔徑為10μm的醋酸纖維濾膜收集樣品；對膜樣處理時，既可將濾膜直接用液氮研磨，也可將樣品從濾膜上刮取下后再用液氮研磨，具體磨樣方式視樣品情況而定；提取試劑以TRIZOL法為優(yōu)。
　　 (2)通過將東海原甲藻細胞色素b(Cyt b)基因做序列比對，設計出符合實時熒光定量檢測要求的引物，并以14種藻為參照藻，對所設計的引物的特異性進行了實驗驗證，表明其

4、有較好的特異性。優(yōu)化了反應體系，在20μL的反轉(zhuǎn)錄體系中，適宜的反轉(zhuǎn)錄RNA量為50 ng～200 ng：PCR模板稀釋10倍或向定量PCR反應體系中加入終濃度為0.2μg/L的牛血清蛋白(BSA)均能有效地降低現(xiàn)場樣品中抑制物的抑制作用，減小干擾。采用SYBR GreenⅠ染料法建立了檢測東海原甲藻Cytb基因的實時熒光定量PCR的標準曲線。得到的曲線方程為：Ct=-3.44×lg[基因拷貝數(shù)]+36.53，其相關(guān)系數(shù)r=0.999。

5、
　　 (3)將PCNA相對表達量法與現(xiàn)場培養(yǎng)法所得的生長率作比較，發(fā)現(xiàn)二者具有很好的一致性，都能反映現(xiàn)場水體中赤潮生物的原位生長情況。將該方法應用到2011年春季長江口外和舟山外海赤潮發(fā)生區(qū)的東海原甲藻生長率現(xiàn)場測定，發(fā)現(xiàn)多數(shù)站位生長率為負值，表明此次赤潮已經(jīng)進入消亡階段。
　　 本研究將PCNA相對表達量法應用于現(xiàn)場，對東海原甲藻赤潮進行生長率測定，很好地反映了赤潮的生長狀況和發(fā)展趨勢，為運用分子生物學技術(shù)對赤潮進行