大鼠急性心肌梗死經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞移植后Cx43-Cx45表達水平的研究.pdf

1、目的：探討體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchyma stemcells，MSCs)的分離、純化、擴增及5-氮胞苷(5-Aza)對MSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞的作用；大鼠急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)模型的建立和經(jīng)5-Aza作用的MSCs移植治療后能否改善梗死心肌縫隙連接蛋白43(Cx43)、Cx45的異常表達。 方法：在無菌條件下分離Wistar大鼠股

2、骨骨髓，采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合進行MSCs培養(yǎng)、純化和擴增。在獲得穩(wěn)定的細胞系后，選取生長良好的MSCs用不同濃度5-Aza分別作用不同時長，收集細胞行透射電鏡觀察并行α-肌動蛋白、Cx43、肌鈣蛋白T的免疫細胞化學(xué)檢測。Wistar大鼠180只，隨機分為4組，每組45只：①正常對照組(Nor組)；②假手術(shù)組(Sham組)；③心肌梗死+生理鹽水組(MI組)；④MSCs移植組(MSCs組)。采用開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支(lef

3、t anterior descending coronary artery，LAD)，術(shù)后10分鐘即行心電圖檢查，S-T段呈弓背向上抬高，幅度超過0.2mV，伴R波振幅降低，認(rèn)為AMI模型制作成功。成功存活7天并補齊的四組Wistar大鼠，按干預(yù)后4周、8周和12周又分為3個亞組，每亞組15只大鼠。MI組和MSCs組7天后二次開胸。MSCs組心肌梗死的邊緣區(qū)和中心區(qū)植入誘導(dǎo)后的MSCs。MI組注射等量生理鹽水。Sham組只開胸未行注射。

4、于術(shù)后4周、8周和12周分別處死動物，取左心室組織在熒光顯微鏡下觀察DAPI標(biāo)記的供體細胞遷移、分布情況；同時取正常區(qū)、邊緣區(qū)、梗死中心區(qū)心肌組織，-80℃保存。提取心臟組織蛋白行Western blotting測定Cx43、Cx45含量。 結(jié)果：Wistar大鼠MSCs經(jīng)過分離、貼壁、純化能在體外進行增殖并保持良好的未分化潛能。經(jīng)10μmol/L5-Aza持續(xù)作用15天的MSCs，8周時呈現(xiàn)出心肌樣細胞的典型改變，并有部分細胞

5、出現(xiàn)自發(fā)搏動，頻率為15-20次/分。電鏡下可見大量糖原顆粒、線粒體和肌絲樣結(jié)構(gòu)。MSCs在體外DAPI標(biāo)記率達100％，隨著時間延長熒光強度逐漸減弱。干預(yù)后4周、8周、12周的Cx43在各組正常區(qū)含量均無差異(P均>0.05)。干預(yù)4周、8周、12周后，在MI組和MSCs組中，缺血區(qū)Cx43的含量均較正常區(qū)明顯減少(P<0.01)；4周、8周、12周MSCs組缺血區(qū)Cx43的含量多于MI組缺血區(qū)(P<0.05)。各組梗死區(qū)Cx43的含

6、量均較正常區(qū)減少。各組梗死區(qū)Cx43的含量均較缺血區(qū)明顯減少(P<0.01)。干預(yù)后8周、12周MSCs組梗死區(qū)Cx43的含量多于MI組梗死區(qū)(P<0.05)。干預(yù)后4周、8周、12周Cx45含量在各組正常區(qū)無顯著差異(P均>0.05)。干預(yù)后4周，在MI組中，缺血區(qū)的Cx45的含量表達多于正常區(qū)(P<0.01)。干預(yù)后8周、12周，MI組缺血區(qū)和正常區(qū)Cx45的含量無區(qū)別(P>0.05)；MSCs組缺血區(qū)Cx45的含量少于正常區(qū)(P<

7、0.01)。干預(yù)后4周、8周、12周MSCs組缺血區(qū)Cx45的含量少于MI組(P<0.05)。各組梗死區(qū)的Cx45含量均較正常區(qū)減少(P<0.01)。4、8、12周MI組中梗死區(qū)Cx45含量少于缺血區(qū)(P<0.01)，8、12周MSCs組中梗死區(qū)Cx45的含量少于缺血區(qū)(P<0.01)。MI組和MSCs組比較，梗死區(qū)Cx45的含量無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：MSCs在體外有良好的增殖能力并保持其未分化潛能特性，MSCs經(jīng)適宜濃度5-A