AF2364抑制精子獲能和受精能力.pdf

1、動物實驗研究表明；AF2364是一種很有潛力的男性避孕藥候選化合物。這一化合物通過干擾精子細胞與支持細胞間的黏附功能,可逆地誘導精母細胞以及精細胞從生精上皮丟失,但不影響精原細胞,從而導致給藥大鼠不育。一旦藥物代謝完成,精原細胞可重新開始精子發(fā)生,動物即可恢復生育能力。AF2364能引起細胞骨架肌動蛋白的聚集和解聚,導致支持細胞與精子細胞間黏附功能降低,最后使未成熟精母細胞和精子細胞從生精上皮丟失。然而AF2364對人類精子的作用尚未了

2、解,探索AF2364在人類精子中的作用及其分子機制,對開發(fā)新一代男性避孕藥具有重要意義。
　　 目的:
　　 研究AF2364對精子的抑制作用及其作用機制。
　　 方法：
　　 1.精子的處理
　　 精子與預溫HTF培養(yǎng)基等量混勻后,500g離心15min,棄去上清,精子用2ml的HTF進行懸浮:精子懸液再用45％和90％Percoll間斷密度梯度離心(600g,15 min),所得下層活力較好精

3、子再用約10倍HTF懸浮,300g離心5 min。棄去上清液,再用HTF調(diào)整精子密度到2-3x107 cells/ml。
　　 1.金霉素染色法評價AF2364對精子獲能和頂體反應(yīng)的影響
　　 處理好的精子進行分組,加入不同濃度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),以及孕酮,隨后精子于37℃進行獲能培養(yǎng)4-5h,然后,分別加入等體積溶劑(作為對照)、并采用CTC染色法(金霉素染色法)評價精子獲能情

4、況。另外,在精子獲能培養(yǎng)5小時后,加入不同濃度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),繼續(xù)培養(yǎng)30min,然后,加入15μM P4(或2μg/ml rhuZP3β),誘發(fā)精子AR,15min,用CTC染色法評價頂體反應(yīng)率。
　　 2.卵子的處理
　　 選用8-10周齡的敘利亞金黃地鼠,陰道涂片觀察,判斷發(fā)情周期,之后注射超排卵激素,通過解剖取出輸卵管中的卵子。將卵子存放在HTF培養(yǎng)基中,加入透明質(zhì)酸

5、酶(2.5mg/ml)去除卵丘細胞,用培養(yǎng)基洗3次,再在胰酶(2.5mg/ml)的作用下,將卵子透明帶去除,并重復用培養(yǎng)基洗3次,放入2℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.精子穿卵實驗評價AF2364對精子受精能力的影響
　　 處理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白對照,于37℃進行獲能培養(yǎng)4-5h,將精子和卵子共培養(yǎng)3小時后,顯微鏡下觀察精子穿透卵子率(PR),以及精子穿卵指數(shù)(PI)。
　　 4.計算機輔

6、助精液分析系統(tǒng)(CASA)評價AF2364對精子活力和精子超激活運動的影響
　　 處理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白對照,于37℃進行獲能培養(yǎng)4-5h,放入到10 mm×10 mm,深度20μm特定的載玻片上,通過計算機對精子的捕捉,隨機選擇10個區(qū)段,在60赫茲下分析精子活力,以及超激活運動參數(shù)。
　　 5.AF2364對Forskolin激動的精子獲能過程的影響
　　 精子獲能培養(yǎng)前,分成6組

7、:陽性對照(孕酮),陰性對照(空白),Forskolin,Forskolin+孕酮,AF2364+Forskolin,AF2364+Forskolin+咖啡因,獲能培養(yǎng)5小時后,CTC染色,比較精子的獲能情況。
　　 6.AF2364在缺氯培養(yǎng)基中對精子獲能的影響
　　 精子培養(yǎng)在缺氯的培養(yǎng)基中,分成空白,孕酮和AF2364三組,獲能培養(yǎng)5小時,CTC染色,觀察精子的獲能情況以及自發(fā)性頂體反應(yīng)情況。
　　 7.酶

8、免疫法測定AF2364作用下獲能精子的cAMP含量
　　 AF2364和對照組精子經(jīng)過獲能培養(yǎng)后,固定,提取cAMP,標準品以及樣品加入到96孔中,通過與一抗,二抗結(jié)合,以及顯色劑的作用下,放入到酶標儀中,讀取吸光度,畫出標準曲線,比較AF2364組和對照組的cAMP含量差異。
　　 結(jié)果：
　　 通過CTC染色法,SPA以及CASA實驗,我們確定了AF2364抑制人類精子獲能和受精的作用。CTC染色法實驗結(jié)果表

9、明,AF2364對人類精子獲能及其頂體反應(yīng)具有明顯的抑制效果,并且對精子獲能的抑制作用具有可逆性。SPA實驗證明了AF2364在精子穿透卵子環(huán)節(jié),具有顯著的抑制作用,模擬了精子受精過程,評價了AF2364對精子受精能力的抑制效果。精子的CASA測試,發(fā)現(xiàn)AF2364不影響精子的活動能力,但是對精子的超激活運動有明顯抑制效果,超激活運動的相關(guān)參數(shù)與對照組有著較大差異,精子超激活率也明顯下降。在設(shè)計了Forskolin以及缺氯培養(yǎng)的兩組實驗