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文檔簡(jiǎn)介
1、本試驗(yàn)的目的是研究Caz+和HC03-調(diào)節(jié)豚鼠精子體外獲能、超激活運(yùn)動(dòng)和蛋白酪氨酸磷酸化的信號(hào)機(jī)制。 1 cAMP促效物對(duì)豚鼠精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)和蛋白酪氨酸磷酸化的作用 將豚鼠精子分別于TALP、缺Ca2+的TALP、缺HCO3-的TALP及分別加有cAMP促效物(1mM dbcAMP和100μM IBMX)的培養(yǎng)液中孵育.取出不同孵育時(shí)間段的精子,分析超激活運(yùn)動(dòng)精子和獲能精子的百分率以及蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化情況
2、,用金霉素( CTC)染色法檢測(cè)精子獲能情況,結(jié)果顯示,缺Ca2+或HCO,-的TALP培養(yǎng)液顯著抑制了超激活運(yùn)動(dòng)和獲能精子的百分率(p<0.01);在缺HC03-的培養(yǎng)液中加入1mMdbcAMP和100μM IBMX顯著提高了超激活運(yùn)動(dòng)精子和獲能精子的百分率,并恢復(fù)到了正常培養(yǎng)下的水平;在缺Ca2+的培養(yǎng)液中加入1mM dbcAMP和100mμIBMX雖然也提高了超激活運(yùn)動(dòng)和獲能精子的百分率但是與正常水平比較還有顯著差異(P<0.01
3、)。Western blotting檢測(cè)蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化,結(jié)果顯示,缺Ca2+或HC03-的TALP培養(yǎng)液抑制了蛋白酪氨酸磷酸化水平的增加;加入dbcAMP和IBMX提高了這兩種情況下的蛋白酪氨酸磷酸化水平,孵育7h時(shí)蛋白酪氨酸磷酸化水平提高到了正常培養(yǎng)水平。 2 PKA抑制劑對(duì)豚鼠精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)和蛋白酪氨酸磷酸化的影響 將豚鼠精子分別于TALP及含有不同濃度的PKA特異性抑制劑H-89(0.1、1、3、
4、5、10μM)的TALP培養(yǎng)液中孵育7h。分析精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)及蛋白酪氨酸磷酸化水平。用金霉素( CTC)染色法檢測(cè)精子獲能情況,Western blotting檢測(cè)蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較(TALP培養(yǎng)液),H-89顯著抑制了精子超激活運(yùn)動(dòng)和獲能,并且這種抑制作用呈濃度依賴性;0.1μM的H-89降低了80、45、40kDa三種蛋白的酪氨酸磷酸化水平,在1μM的H-89作用下僅檢測(cè)到40kDa的酪氨酸
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