豬多能干細胞中LAMININ基因表達譜的分析及其可變剪切體的分子克隆.pdf

1、層粘連蛋白(Laminin，LN)是細胞膜的重要成分，采用LN作為細胞基質(zhì)培養(yǎng)多能干細胞，可以維持干細胞的自我更新和多能性。LN家族中有15種不同的亞型，每一種亞型由三條肽鏈(α、β、γ)組成，形成十字架結(jié)構的異源三聚體。其中LamininA5(LAMA5)對于維持多能干細胞的生長有重要作用。本研究旨在檢測豬不同組織和細胞中LAMININ的表達情況，研究LN在多能干細胞分化過程中的時空表達特性;通過生物信息學分析和分子克隆，確認豬LAM

2、A5基因的存在和表達變化;發(fā)現(xiàn)并分子克隆了與豬多能干細胞特性相關的Laminin B1-a(LAMB1-a)可變剪接體。本研究豐富了對豬多能干細胞培養(yǎng)基質(zhì)研究的信息，為研究豬干細胞多能性的維持提供了理論依據(jù)。
　　本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.LAMININ在豬組織和細胞中的表達譜分析
　　用RT-PCR檢測豬不同組織（肝臟、心臟、肺、胃、腦、睪丸、脂肪、顆粒細胞組織）、體細胞（肝細胞、脂肪細胞、豬胎兒成纖維細胞

3、）和多能干細胞(DOX-iPS、PS11、PS23)中LAMININ不同亞型的表達情況。結(jié)果表明，不同組織和細胞中LAMININ的表達存在明顯差異。通過比對組織來源和細胞來源的樣品發(fā)現(xiàn)，在細胞中LAMININ的表達特異性更加突出，其中在PEF細胞中LAMININ的表達特征為:LAMA45-LAMB1/2-LAMC1/2（即LN-411、 LN-421、LN-511和LN-521）;在豬iPS細胞中LAMININ的表達特征為:LAMA15

4、-LAMB1-a/2-LAMC1(即LN-11a1、LN-121、LN-51a1和LN-521)。
　　2.豬LAMA5的生物學分析和克隆
　　未注釋有豬LAMA5基因的序列信息和相關報道。為此我們運用NCBI和UCSC等數(shù)據(jù)庫，分析人、牛和山羊的LAMA5基因序列，預測豬LAMA5基因，以RPS21和CABLES2基因?qū)ωi基因組數(shù)據(jù)庫(Sscrofa11.1)中LAMA5的可能序列區(qū)域進行定位。通過DNAMAN(V6)軟件

5、進行比對，確認了豬LAMA5的序列，并設計特異性引物，從豬肺組織樣cDNA中克隆了長度為731 bp的豬LAMA5基因序列。測序結(jié)果與人和牛LAMA5序列高度一致，序列上傳至GENBANK，獲得登錄號:KY622023。
　　3.豬多能干細胞中LAMININ的表達特性和LAMB1-a可變剪接體的發(fā)現(xiàn)
　　通過檢測，發(fā)現(xiàn)豬iPS細胞中，LAMB1出現(xiàn)了兩條特異性條帶，為了進一步研究LAMB1的性質(zhì)，對克隆的兩條特異性條帶（LA

6、MB1505bp、LAMB1-a639bp）進行測序，結(jié)果顯示與NCBI中已有的LAMB1-X1和LAMB1-X2序列不一樣，發(fā)現(xiàn)LAMB1-a是一個新的可變剪接體。
　　為了進一步探討LAMB1與多能干細胞的相關性，選取豬PEF和豬多能干細胞DOX-iPS及分化的iPS細胞進行了檢測。結(jié)果顯示，隨著多能干細胞形態(tài)的改變，細胞團形態(tài)逐漸消失，LAMB1-a的表達逐漸下降，當再次運用DOX-iPS培養(yǎng)基培養(yǎng)后，當細胞團形態(tài)再次恢復的