二甲基亞砜對(duì)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響及分化后NADPH氧化酶表達(dá)的變化.pdf

1、目的：①體外探討不同濃度的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）對(duì)誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響；②研究 P19細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化后細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶水平的改變。
　　方法：①原代生長(zhǎng)的P19細(xì)胞予以α-MEM完全培養(yǎng)液（含90％α-MEM、10%FBS、青霉素100u/ml、鏈霉素100ug/ml）培養(yǎng)。選取合適的該細(xì)胞株，予以適當(dāng)濃度的胰酶處理后，以約1×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移到10 c

2、m大小的懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)皿，加入不同濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)液10 ml（分別含0.4%，0.9%及1.4% DMSO的完全培養(yǎng)液），懸浮培養(yǎng)。第3天以7 ml的上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行不完全換液。第4天待培養(yǎng)皿內(nèi)有大量細(xì)胞聚集體形成時(shí)，取6 cm大小組織培養(yǎng)皿，吸取適量該細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)入其中使其貼壁生長(zhǎng)，后以完全培養(yǎng)液每?jī)商鞊Q液一次，培養(yǎng)至13天，在顯微鏡下觀察不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)。收集各組不同誘導(dǎo)時(shí)間的細(xì)胞，行Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)肌鈣蛋白

3、I(cTnI)的表達(dá)情況，以確定其向心肌細(xì)胞的分化；對(duì)各組相同分化時(shí)間的P19細(xì)胞行Western Blot比較cTnI蛋白的表達(dá)，以比較分化的程度；②行Western Blot檢測(cè)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化前后細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的兩個(gè)亞基p22-phox以及gp91-phox水平的變化；③應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，cTnI蛋白水平及分化前后細(xì)胞內(nèi)p22-phox及gp91-phox蛋白水平的比較采用t檢驗(yàn)，Western

4、 blot結(jié)果目的條帶應(yīng)用軟件Image J進(jìn)行灰度值計(jì)算，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取P=0.05。
　　結(jié)果：①P19細(xì)胞經(jīng)0.4%DMSO誘導(dǎo)分化，于第9天開始檢測(cè)到cTnI表達(dá)陽(yáng)性，第11天cTnI表達(dá)高于第9天，同時(shí)第13天也高于第11天；經(jīng)0.9%DMSO誘導(dǎo)分化，于第7天開始檢測(cè)到cTnI表達(dá)陽(yáng)性，第9天cTnI表達(dá)高于第7天，同時(shí)第11天高于第9天，第13天也高于第11天，上述差異均具統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）；1.4%DMSO處理的

5、P19細(xì)胞于誘導(dǎo)第三天大量凋亡，未能誘導(dǎo)成功。②分別經(jīng)0.4%DMSO和0.9% DMSO誘導(dǎo)的P19細(xì)胞，分化相同時(shí)間后者較前者cTnI表達(dá)高，差異具統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。③P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化后細(xì)胞內(nèi) p22-phox及gp91-phox蛋白水平較分化前高，差異具統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：DMSO在一定條件下可誘導(dǎo)P19細(xì)胞在體外向心肌細(xì)胞分化；DMSO的誘導(dǎo)作用在一定范圍內(nèi)與其濃度成正相關(guān)，然而濃度過高可