乳腺髓樣癌Bcap-37細胞系腫瘤干細胞的分選鑒定及槐耳清膏對乳腺癌干細胞作用的初步研究.pdf

1、乳腺癌是我國女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。髓樣癌是乳腺癌中的一種特殊組織學類型,其獨特的病理特征和較好的預后之間仍有許多不明之處,需要更進一步的研究。腫瘤的治療一直是困擾臨床的難點,因此,篩選抗腫瘤的藥物成為研究熱點。
　　腫瘤干細胞(cancerstemcells,CSCs)是一群具有較強自我更新能力、能夠多向分化的細胞,且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)相關(guān)。研究表明利用標記物能夠分選出某種腫瘤中的CSCs

2、。乳腺髓樣癌的干細胞標記物尚無報道,因此,尋找和鑒定分選乳腺髓樣癌干細胞的腫瘤標記物,是進一步研究乳腺髓樣癌生物學特性等的基礎。近年來還研究發(fā)現(xiàn):腫瘤的復發(fā)與腫瘤干細胞具有明顯相關(guān),因此,尋找能夠殺傷CSCs的藥物對臨床治療顯得尤為重要。
　　針對上述問題,本研究以乳腺髓樣癌細胞系Bcap37為細胞模型,PROCR(endothelialproteinCreceptor)和ESA(epithelialspecificantigen

3、)為分選標記物,檢測Bcap37細胞中PROCR+/ESA+細胞比例,并通過NON/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗;克隆形成實驗、細胞周期實驗以及干性相關(guān)基因檢測等體外實驗,以證明PROCR+/ESA+分選的細胞是否具有干細胞特征。為了驗證槐耳清膏是否對干細胞具有抑制作用,將槐耳清膏分別加入到PROCR+/ESA+的細胞中,并觀察給藥前后細胞克隆形成能力的變化;同時,為進一步驗證槐耳清膏是否對腫瘤干細胞有殺傷或者抑制作用,本研究選用了乳腺癌另

4、一細胞模型--SUM159細胞系進行進一步的驗證,通過槐耳清膏給藥前后對乳腺癌SUM159細胞成球能力、克隆形成能力的影響,并且運用流式細胞術(shù)檢測給藥前后,SUM159中ALDH1hing比例的變化。初步研究槐耳清膏是否對乳腺癌干細胞(breastcancerstemcells,BCSCs)具有能殺傷或者抑制效果,為臨床治療提供新的線索。
　　研究方法和主要結(jié)果：
　　1.乳腺髓樣癌Bcap-37細胞系腫瘤干細胞的分選鑒定<

5、br>　　方法:以CD24/CD44、PROCR/ESA為分選標記物,運用流式細胞術(shù)分選乳腺髓樣癌Bacp-37細胞,通過體外克隆形成實驗、細胞周期實驗、干性相關(guān)基因檢測等實驗,體內(nèi)NOD/SCID動物成瘤模型來證明:CD24/CD44不是該細胞系最好的干細胞標記物,而以PROCR+/ESA+分選的細胞具有干細胞特征。
　　結(jié)果：
　　1.流式細胞術(shù)檢測Bcap37細胞系中,CD44+/CD24-/low的比例為52.7％,

6、PROCR+/ESA+的比例為3.2%;克隆形成實驗結(jié)果表明:CD44+/CD24-/low分選細胞克隆形成的數(shù)目和NonCD44+/CD24-/low分選的細胞克隆形成數(shù)目無差異(P>0.05);PROCR+/ESA+細胞克隆形成的數(shù)目大于PROCR-/ESA-細胞(P<0.05),提示PROCR+/ESA+細胞具有較強的克隆形成能力。細胞周期實驗表明:PROCR+/ESA+的細胞能夠在48小時以內(nèi)從G1期進入G2和S期,而PROCR

7、-/ESA-的細胞幾乎不進入分裂周期;干性相關(guān)基因檢測實驗表明:PROCR+/ESA+的細胞高表達NANOG、OCT4和BMI1(P<0.05);NOD/SCID動物成瘤模型實驗表明:PROCR+/ESA+的細胞在成瘤的數(shù)目、成瘤的體積均要大于PROCR-/ESA-細胞(P<0.05)。
　　2.槐耳清膏對乳腺癌干細胞作用的初步研究
　　方法:觀察槐耳清膏給藥前后對PROCR+/ESA+的Bcap-37細胞克隆形成的影響;應

8、用CCK-8法檢測槐耳清膏對SUM-159細胞的IC50值,并觀察給藥前后SUM-159細胞形態(tài)學變化、對克隆形成能力和成球能力的影響,以及用流式細胞術(shù)檢測給藥前后SUM-159細胞的ALDH1high細胞比例變化。
　　結(jié)果:槐耳清膏能抑制PROCR+/ESA+的Bcap-37細胞的克隆形成(P<0.05);CCK-8檢測結(jié)果顯示:槐耳清膏對Sum-159細胞系的IC50值約為10mg/mL。以濃度為0mg/mL、1mg/mL、

9、10mg/mL的槐耳清膏作用于Sum-159細胞,發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加,克隆形成的菌落數(shù)目逐漸減少(p<0.05)。成球數(shù)目和大小也逐漸降低(p<0.05)。以10mg/mL的濃度作用該細胞后,用流式細胞術(shù)檢測ALDH1比例發(fā)現(xiàn),ALDH1high細胞的比例由給藥前的2.8%降到1.5%,而以1μg/mL濃度的紫杉醇作用該細胞后,ALDH1high細胞的比例由給藥前的2.8%升到9.1%。
　　結(jié)論：
　　1、FCM分選乳腺髓

10、樣癌細胞系Bcap37中PROCR+/ESA+亞群細胞具有較強的成瘤能力和多向分化能力,具有CSCs的特性。PROCR+/ESA+可作為乳腺髓樣癌細胞系Bcap-37的CSCs細胞亞群分選標記物。
　　2、槐耳清膏對人乳腺癌細胞系Bcap37細胞的克隆形成、Sum159細胞的克隆形成和成球能力具有明顯的抑制作用。同時能夠降低Sum-159細胞中ALDH1high細胞的比例,提示槐耳清膏可能對乳腺癌Sum-159細胞中的干細胞具有一