組織工程技術(shù)制備人膝半月板組織的初步研究.pdf

1、半月板是膝關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)之一,具有承受和傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)和穩(wěn)定關(guān)節(jié)等作用<'[1.2.3]>.半月板因創(chuàng)傷和先天性畸形在骨科臨床工作中相當(dāng)多見<'[4]>,目前的治療手段多半是手術(shù)切除或部分切除損傷或畸形的半月板<'[4.5]>,解除患者的病痛,取得了相當(dāng)滿意的效果,因?yàn)槿绻贿M(jìn)行手術(shù)治療,任其病情自然發(fā)展,往往導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)晚期骨性關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn),手術(shù)切除或部分切除半月板雖然是目前治療半月板損傷或畸形的主要手段,但其遠(yuǎn)期效果并非

2、十全十美,仍然有一些不盡人意的并發(fā)癥出現(xiàn)<'[6.7]>,所以,隨著組織工程技術(shù)<'[59]>的出現(xiàn),人們追求更加完美的手段來(lái)替代現(xiàn)有的治療措施,組織工程技術(shù)是人們?cè)噲D用來(lái)改變現(xiàn)有治療手段的方法之一<'[8.9.10.11]>.該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從損傷或畸形的半月板組織中獲取纖維軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞,在體外單層培養(yǎng)并在各種細(xì)胞因子作用下大量增殖分化,產(chǎn)生大量的種子細(xì)胞,同時(shí)檢測(cè)種子細(xì)胞的生物學(xué)特性<'[12.13]>,之后,擬將種子細(xì)胞與支架結(jié)

3、合,種植于裸鼠皮下,構(gòu)建出組織工程化人膝關(guān)節(jié)半月板,最后檢測(cè)組織工程化半月板的生物學(xué)特性,并比較組織工程化半月板與半月板之間的差異.內(nèi)容:1.種子細(xì)胞的優(yōu)化獲取的方法:從手術(shù)中切除下來(lái)無(wú)變形或嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的半月板組織,經(jīng)胰蛋白酶,透明質(zhì)酸酶和膠原酶的消化而獲取人膝關(guān)節(jié)半月板纖維軟骨細(xì)胞,進(jìn)行原代和傳代單層培養(yǎng).2.測(cè)定原代和傳代的纖維軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性:研究方法包括細(xì)胞倒置顯微鏡下的形態(tài)表現(xiàn),細(xì)胞計(jì)數(shù),HE染色,免疫組化染色,細(xì)胞貼壁

4、率,生長(zhǎng)曲線,各種細(xì)胞因子作用下纖維軟骨細(xì)胞的增殖情況如細(xì)胞數(shù)目的增加、總RNA含量的測(cè)定、特異性mRNA表達(dá)等.3.構(gòu)建組織工程化人膝關(guān)節(jié)半月板,將不同代次的纖維軟骨細(xì)胞與支架結(jié)合,體外培養(yǎng)一段時(shí)間后植入裸鼠皮下,在不同的時(shí)間段,分別取出,測(cè)定其生物學(xué)特性,并與正常半月板的生物學(xué)特性進(jìn)行比較,因此檢驗(yàn)組織工程化半月板是否能滿足臨床需要.結(jié)果:1.手術(shù)中切下的無(wú)炎癥反應(yīng)或沒(méi)有變性的人膝關(guān)節(jié)半月板組織可以作為種子細(xì)胞的來(lái)源之一<'[14]

5、>,通過(guò)酶消化法<'[15.16]>,能夠獲取大量的種子細(xì)胞,作為組織工程種子細(xì)胞的主要來(lái)源,滿足實(shí)驗(yàn)的要求.2.纖維軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性:(1)纖維軟骨細(xì)胞的貼壁率隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng),貼壁率逐漸增加,原代和傳代細(xì)胞之間的貼壁率有明顯的差異,適宜的接種密度適合于細(xì)胞增殖分化接種密度0.4×10<'4>/cm<'2>細(xì)胞增殖緩慢,而接種密度大于4×10<'4>/cm<'2>無(wú)助于提高小貼壁率;含10﹪小牛血清的DMEM-F<,12>培養(yǎng)劑

6、適合于細(xì)胞增殖分化,提高血清濃度并不能增加細(xì)胞的貼壁率;(2)纖維軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線符合一般的規(guī)律<'[17]>,接種后第一天都有微小的下降,之后逐漸上升,達(dá)到平臺(tái)期,接著緩慢下降.(3)Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá):體外單層培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞能表達(dá)Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA,在各種細(xì)胞因子刺激之下mRNA表達(dá)上調(diào),總RNA量比未受細(xì)胞因子刺激的情況下多.兩者有明顯的差異(P<0.05).(4)甲苯胺藍(lán)染色顯示蛋白多糖主要是GAG的合成.3

7、.組織工程化半月板外觀形態(tài)具有接近正常半月板的結(jié)構(gòu),剖面結(jié)構(gòu)致密,纖維排列縱橫交錯(cuò),組織切片可以明顯顯示出纖維軟骨細(xì)胞,免疫組化檢測(cè)可以測(cè)出Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的形成,MRI檢測(cè)具有接近正常半月板的低信號(hào)影像特征<'[18.19]>.結(jié)論:1.手術(shù)中切除下來(lái)的半月板組織可以作為組織工程培養(yǎng)的種子細(xì)胞的來(lái)源之一,經(jīng)過(guò)優(yōu)化獲取可以得到大量的種子細(xì)胞.2.體外單層培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞具有正常細(xì)胞的生物學(xué)特性,符合作為種子細(xì)胞的多種生物學(xué)要求.