雜色曲霉素對體外培養(yǎng)人胃粘膜上皮細(xì)胞HLA-1分子表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:雜色曲霉素(sterigmatocystin,ST)是雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物,在人類食品及動(dòng)物飼料中其污染普遍存在,是一種具有致突變、致癌性的真菌毒素。針對ST在我國胃癌高發(fā)區(qū)居民糧食中存在的高污染狀況,我們對ST的作用進(jìn)行了系列的研究工作,以期揭示其高污染狀況與腫瘤高發(fā)之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明,ST處理可引起體外培養(yǎng)的人胚肺和胃粘膜細(xì)胞p53第八外顯子和Ki-ras基因的突變;經(jīng)口灌喂ST可誘發(fā)小鼠肺腺癌發(fā)

2、生和腺胃粘膜發(fā)生異型增生,提示ST具有一定的致癌性和致突變性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)ST對小鼠和人免疫細(xì)胞功能具有明顯的影響,表現(xiàn)在ST可抑制小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-γ的表達(dá);抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12的表達(dá);誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡并抑制其IL-2的分泌;降低人外周血單個(gè)核細(xì)胞表面HLA-I分子的表達(dá)、抑制TAP1基因表達(dá)等,上述結(jié)果提示ST暴露可對機(jī)體的免疫功能發(fā)揮一定的負(fù)面影響。
　　 機(jī)體的免疫監(jiān)視功能在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展

3、過程中發(fā)揮著非常重要的作用。其中人類白細(xì)胞抗原-I(human leukocyte antigen-I,HLA-I)是機(jī)體免疫監(jiān)視功能相關(guān)的重要分子。HLA-I分子分布于所有有核細(xì)胞表面,可與內(nèi)源性抗原肽結(jié)合,并將其提呈給CD8+ T淋巴細(xì)胞誘發(fā)特異性細(xì)胞殺傷效應(yīng),在機(jī)體抗病毒感染、監(jiān)視和清除體內(nèi)突變細(xì)胞過程中起著重要的作用。在HLA-I分子的組裝、成熟、向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)以及對T淋巴細(xì)胞的抗原提呈等過程中,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的TAP分子(T

4、AP1和TAP2兩個(gè)亞基組成)起著關(guān)鍵作用。TAP基因缺失的細(xì)胞株中,HLA-I分子的組裝、成熟以及轉(zhuǎn)運(yùn)等生物合成功能方面明顯低于正常細(xì)胞株。將TAP基因轉(zhuǎn)染低表達(dá)TAP的腫瘤細(xì)胞,可使細(xì)胞表面HLA-I分子的表達(dá)明顯增加,同時(shí)使CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)對腫瘤細(xì)胞的敏感性相應(yīng)地增加。這些結(jié)果提示TAP表達(dá)與HLA-I分子表達(dá)以及CTL殺傷功能密切相關(guān),TAP和HLA-I分子表達(dá)的降低或缺失有利于細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視作用。
　

5、　 TAP和HLA-I分子表達(dá)降低或缺失可見于人類許多腫瘤細(xì)胞中,如小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、食管癌、白血病以及星形細(xì)胞瘤等,并且其表達(dá)與腫瘤的分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織中CD3+/CD8+淋巴細(xì)胞的浸潤以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。此外,一些具有致癌性的環(huán)境因素可以引起非腫瘤細(xì)胞中TAP以及HLA-I分子表達(dá)的抑制,如伏馬菌素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及煙葉提取物等,細(xì)胞表面HLA-I表達(dá)的降低有助于細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,使

6、低表達(dá)HLA-I的細(xì)胞發(fā)生癌變成為可能。
　　 我們前期研究發(fā)現(xiàn),ST可抑制人外周血單個(gè)核細(xì)胞表面HLA-I分子以及TAP1的表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)ST可降低體外培養(yǎng)的正常人食管上皮細(xì)胞表面HLA-I分子表達(dá)。鑒于HLA-I的正常表達(dá)在維持免疫監(jiān)視中的重要作用,并針對ST在我國胃癌高發(fā)區(qū)居民糧食中存在的高污染狀況,本研究中我們以體外培養(yǎng)的人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)作為研究對象,觀察了ST對細(xì)胞表面HLA-I分子以及TAP1表達(dá)的影響

7、;并進(jìn)一步構(gòu)建TAP1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞,對雜色曲霉素引起HLA-I分子改變的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 方法:
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　 1.1正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 用含10％胎牛血清、105 U/L青霉素以及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5％CO2溫箱中體外培養(yǎng)正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞,細(xì)胞呈貼壁生長。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞(傳代后24h

8、)隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組和各個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予DMSO溶解并經(jīng)生理鹽水稀釋的ST,使其終濃度分別為100μg/L、500μg/L、1000μg/L和2000μg/L,對照組給予等體積的生理鹽水,溶劑對照組給予等體積DMSO溶液,于實(shí)驗(yàn)處理相應(yīng)的時(shí)間后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。
　　 1.2人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　 采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoil-hypaque densit

9、y gradientcentrifugation)分離人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞,于含10％胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),加入PHA至終濃度300μg/mL。培養(yǎng)48h收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA用于獲得人全長TAP1基因,構(gòu)建TAP1真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2半定量RT-PCR法
　　 2.1細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量
　　 采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總

10、RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性,并經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測。
　　 2.2反轉(zhuǎn)錄以及PCR反應(yīng)
　　 取2μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。所用引物序列如下:TAP1 Sense:5'-GCTCAGCCGATACCTTCA-3';Anti-sense:5'-CCACTTTCAGCAGCATAACC-3'.HLA-A Sense:5'-CCTACGACGGCAAGGATTACA

11、-3';Anti-sense:5'-ACATCACGGCAG CGACCA-3'.HLA-B Sense:5'-CTACGACGGCAAGGATTAC-3';5'-GGTGGACTGGGAAGACG-3'.HLA-C Sense:5'-GCAGTTCGTGCGGTTCG-3':5'-GTCTCCTTCCCGTTCTCC-3'.β2m Sense:5'-TCAT CCATCCGACATTG-3';Anti-sense5'-GCAGGCAT

12、ACTCATCTTTT-3'.GADPH Sense:5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3';Anti-sense:5'-CCTGGAAGATGGTGA TGGG-3'.采用凝膠分析軟件(BIO-LD)進(jìn)行定量分析,各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值來表示目的基因的相對表達(dá)量。本研究中采用此方法檢測不同濃度ST處理后,GES-1細(xì)胞內(nèi)HLA-I重鏈(HLA-A,HLA-B,HLA-C)、β2m鏈和TAP1在mRNA

13、水平表達(dá)的影響。
　　 3蛋白免疫印跡(Westem Blot)
　　 提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)15％SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上,5％脫脂奶37℃封閉2h。一抗(1:200)4℃過夜,二抗(1:2000)37℃溫育2 h,ECL顯色。Snygene全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá),以β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照,以TAP1、HLA-I與β-肌動(dòng)蛋白的比值分別表示其相對表達(dá)量。
　　 4 TAP1真核表

14、達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 4.1質(zhì)粒構(gòu)建:
　　 以人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA為模板,經(jīng)RT-PCR反應(yīng)獲得人全長TAP1基因,以pcDNA3.1/V5-His B為載體,經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等基因重組技術(shù),構(gòu)建含人TAP1基因全長的pcDNA3.1/V5-His-TAP1質(zhì)粒。所獲得的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定,初步證實(shí)為陽性重組載體。
　　 4.2測序
　　 由Takara公司提供測序服務(wù),結(jié)果與Geneba

15、nk序列(L21204)公布的人TAP1全長cDNA序列比較證實(shí)其序列的準(zhǔn)確性。
　　 5細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　 轉(zhuǎn)染前一天,將處于對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),于不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞密度為60％～80％,第二天進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白對照組、pcDNA3.1空質(zhì)粒組(空質(zhì)粒組)和pcDNA3.1/V5-His-TAP1質(zhì)粒組(TAP1質(zhì)粒組)。根據(jù)lipofectamineTM2000的試劑說明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染G

16、ES-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western blot和FCM檢測轉(zhuǎn)染后TAP1、HLA-I的表達(dá)情況,觀察構(gòu)建的質(zhì)粒在GES-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　 GES-1細(xì)胞預(yù)先經(jīng)1000μg/L的ST預(yù)處理24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為ST+空質(zhì)粒組和ST+TAP1質(zhì)粒組。轉(zhuǎn)染后24h收集細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR、Western blot觀察轉(zhuǎn)染TAP1對ST處理GES-1細(xì)胞的HL

17、A-I表達(dá)的影響。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行兩樣本T檢驗(yàn)與單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),結(jié)果用(-x)±s表示。
　　 結(jié)論:
　　 1給予GES-1細(xì)胞不同濃度ST處理,可不同程度地抑制細(xì)胞HLA-I分子在mRNA和蛋白水平的表達(dá),以1000μg/L和2000μg/L的ST作用最為顯著。
　　 21000μg/L和2

18、000μg/LST處理GES-1細(xì)胞,可明顯降低GES-1細(xì)胞內(nèi)TAP1分子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 3成功構(gòu)建了人TAP1真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TAP1。將其轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞顯示較高的轉(zhuǎn)染效率,可用于TAP1功能研究。
　　 4 TAP1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞能夠上調(diào)細(xì)胞表面HLA-I分子的表達(dá)。
　　 5 TAP1轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)ST對GES-1細(xì)胞HLA-I分子表達(dá)的抑制作