LAIR家族分子、Ep-CAM及其相互作用.pdf

1、該實驗主要包括以下五個部分.第一,通過RT-PCR,從白血病細胞系Jurkat和HL-60中獲得了4種新的LAIR-1異型,按照分子量的大小和來源分別命名為L-1、L-2、H-1和H-2.其中,L-1、H-1和H-2具有完整的開放讀框,L-1和H-2包含了LAIR的Ig結構域.LAIR-1異型可能與白血病中異常的選擇性剪切相關.第二,構建了LAIR-1胞膜外區(qū)真核(LAIR-1-myc)和原核(LAIR-1-GST)表達質(zhì)粒,表達了相應

2、蛋白.分別通過抗c-myc單抗交聯(lián)的Sepharose 4B和谷胱甘肽交聯(lián)的Sepharose 4B純化,制備了LAIR-1多抗.Western Blot證實了HL-60中表達小分子量的LAIR相關蛋白.第三,通過RT-PCR從腎綜合征出血熱患者PBMC中克隆了LAIR-2cDNA.構建了原核(LAIR-2-GST)和真核(LAIR-2-myc)融合蛋白基因并表達和純化.應用淋巴細胞雜交瘤技術,制備了4株能夠與真核蛋白反應的單克隆抗體,

3、抗體腹水效價為10<'-6>.并建立了夾心ELISA檢測LAIR-2方法.第四,通過RT-PCR從直腸癌和乳腺癌腫瘤組織中克隆了Ep-CAMcDNA.構建了Ep-CAM-GST融合蛋白表達基因并表達和純化,制備了15株單克隆抗體.不同的Ep-CAM mAb在免疫組化方面的染色情況不同,2A9只著染腺體細胞膜,而4B11則能夠著染腺上皮的細胞膜、核膜以及間質(zhì)中的炎性細胞.第五,利用ELISA和共聚焦的方法鑒定了LAIR-1、LAIR-2和

4、Ep-CAM之間作用的表位和相互作用的關系.通過Ep-CAM特異性單抗的阻斷實驗,發(fā)現(xiàn)了LAIR-1和LAIR-2識別的表位不同.其中,2A9能夠同時阻斷LAIR-1和LAIR-2與Ep-CAM結合,2D5、2D7和2H6只選擇性地阻斷LAIR-1與Ep-CAM結合,3A6能夠顯著提高LAIR-2與Ep-CAM結合的親和力.通過LAIR-1和LAIR-2分別與Ep-CAM結合后,再加入LAIR-1和LAIR-2HRP標記的單抗,發(fā)現(xiàn)FM