冠心病血瘀證家系的易患基因研究.pdf

1、第一部分 冠心病血瘀證家系與ACE、FVII、ApoE、Pal-1基因多態(tài)性的連鎖研究 背景：CHD是一種多因素疾病，受環(huán)境和遺傳等多因素的影響，為有明顯遺傳傾向的多基因病。CHD的發(fā)生與發(fā)展與多種易患基因多態(tài)性有關(guān)，尤其與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶插入／缺失(ACE I／D)基因多態(tài)性、載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性、凝血因子VII(FVII)基因多態(tài)性、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因多態(tài)性等密切相關(guān)，它們通過調(diào)控脂質(zhì)代

2、謝、凝血功能和血管內(nèi)皮功能而影響CHD臨床表型。中醫(yī)理論認(rèn)為冠心病基本病機為心脈瘀阻，血瘀證是CHD最常見的證型，而ApoE、FVII、ACE、PAI-1基因多態(tài)性是否為CHD血瘀證家系的遺傳分子生物學(xué)標(biāo)志之一，值得深入研究。 目的：了解湖南漢族家系人群ACE、FVII、ApoE、PAI-1基因各基因型分布頻率，觀察ACE基因(I／D)多態(tài)性、FVII基因(M1／M2)多態(tài)性、ApoE基因(ε2、ε3、ε4)多態(tài)性、PA I-1

3、基因多態(tài)性與CHD血瘀證家系的關(guān)系及對CHD血瘀證易患影響。 方法：本研究采用病例對照設(shè)計，篩選25個CHD血瘀證家系、15個CHD非血瘀證家系及10個健康人家系為研究對象。采用直接PCR和PCR-RFLP技術(shù)檢測ACE基因I／D、apoE基因(ε2、ε3、ε4)、FVlI(M1／M2)基因多態(tài)性，用PCR-VNTR技術(shù)檢測PAI-1基因多態(tài)性。 用條件Logistic回歸進(jìn)行受累親屬對分析(APM)分析，將家系組成的A

4、PM對用單變量的條件Logistic回歸以及調(diào)整傳統(tǒng)危險因素后的多變量條件Logistic回歸分析；在對FVII、ACE、ApoE、PAI-1基因多態(tài)與冠心病基因存在關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)上；利用核心家系資料進(jìn)行單體型相對風(fēng)險分析(HHRR)，連鎖不平衡檢驗(TDT)分析，檢驗該基因座是否與中國湖南漢族人群冠心病血瘀證基因存在連鎖。 結(jié)果： 1．湖南漢族家系人群中：①ACE基因型分布在雙親中，DD 12.50％，ID 48.21％，Ⅱ

5、39.29％；Ⅰ等位基因頻率63.39％，D等位基因頻率36.61％。在患者中，DD 14.29％，ID 53.57％，Ⅱ 32.14％；Ⅰ等位基因頻率58.93％，D等位基因頻率41.07％。②FVⅡ基因型分布在雙親中M1等位基因頻率78.57％，患者的等位基因M1頻率85.71％。③ApoE基因型分布在雙親中，E2／3 8.93％，E2／4 10.71％，E3／3 53.57％，E 3／4 23.21％，E4／4 3.58％；等位基

6、因ε2、ε3、ε4頻率分別為9.82％、69.64％、20.54％；患者中，E2／3 14.29％，E2／47.14％，E3／3 67.86％，E3／4 10.71％，E4／4 0％： ε2、ε3、ε4等位基因頻率分別為10.71％、80.36％、8.93％。 2．在單體型相對風(fēng)險分析(HHRR)中，ACE的D基因與冠心病血瘀證不關(guān)聯(lián)，F(xiàn)VⅡ的M1基因和ApoE的ε4基因及PAⅠ-1 CA18基因多態(tài)性與冠心病血瘀證相關(guān)聯(lián)。

7、 3．在連鎖不平衡分析中，ACE的D等位基因和FVⅡ的M1等位基因與冠心病血瘀證易患位點不連鎖；ApoE的ε4等位基因和PAⅠ-1的CA18等位基因與冠心病血瘀證易患位點連鎖，可能為中國湖南漢族人群冠心病血瘀證的易患基因。 4．在受累親屬對分析中，II、ID、DD種基因型和M1M1、M1M2、M2M2種基因型在受累親屬對分析中分布無顯著差別，PAI-1基因型CA18和ApoEε4基因型在血瘀證受累親屬對分析中分布有顯著差別

8、。 結(jié)論： 1．本項研究CHD家系A(chǔ)CE、FVⅡ、ApoE、PAⅠ-1基因的基因型、等位基因都沒有偏離Hardy-Weinberg平衡。 2．ACE的D等位基因可能與冠心病血瘀證不關(guān)聯(lián)，F(xiàn)VII的M 1等位基因和ApoE的￡4等位基因及PAⅠ-1 CA18等位基因可能與冠心病血瘀證相關(guān)聯(lián)。3．ACE的D等位基因和FVⅡ的M 1等位基因可能不是中國湖南漢族人群冠心病血瘀證的易患基因；而ApoE等位基因￡4和PAⅠ-

9、1等位基因CA18與冠心病血瘀證易患位點連鎖，可能為中國湖南漢族人群冠心病血瘀證的易患基因，且是CHD家系血瘀證獨立的危險因素。 4．冠心病血瘀證可能是一種具有遺傳傾向的“多基因證”。第二部分 冠心病血瘀證家系與脂質(zhì)代謝、凝血功能及血管內(nèi)皮功能相關(guān)性研究 背景：已有的研究證明，CHD血瘀證的形成與體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮損傷及凝血機制失常，血液處于血栓前高凝狀態(tài)的病理生理過程相似，而且CHD的發(fā)病有家族聚集傾向，其

10、發(fā)病率高于群體發(fā)病率<'[2-3]>。血脂紊亂是CHD發(fā)病與進(jìn)展之重要危險因素之一，可作為中醫(yī)辨證分型的一個客觀指標(biāo)；血瘀證患者存在著血栓前高凝和纖溶功能低下狀態(tài)，其血栓形成是氣滯血瘀和氣虛血瘀的病理基礎(chǔ)；血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能失調(diào)可能是構(gòu)成冠心病血瘀證的病理基礎(chǔ)之一。中醫(yī)認(rèn)為冠心病基本病機為心脈瘀阻，臨床和實驗研究表明血瘀證是CHD最常見的證型之一。因此，脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮損傷及凝血機制失?？赡苁荂HD血瘀證家系的三個遺傳易患特征

11、。 目的： 1．分析CHD血瘀證家系患者脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮功能及凝血機制相關(guān)指標(biāo)，探討這些指標(biāo)與CHD血瘀證家系的遺傳易患關(guān)系。 2．觀察家系中ACE基因Ⅰ／D多態(tài)性對ET／NO的影響、FVⅡ基因M1／M2 多態(tài)性與血漿FVII活性(FVIIc)的關(guān)系，及PAI-1基因多態(tài)性對PAI-1活性的影響。方法：本研究采用病例對照設(shè)計，篩選25個CHD血瘀證家系、15個CHD非血瘀證家系患者及10個健康人家系為研

12、究對象。采用硝酸還原酶法測定一氧化氮(N0)，放免法測定內(nèi)皮素(ET)，血管緊張素Ⅱ(Ag Ⅱ)，發(fā)色底物法檢測纖溶酶原激活劑抑制物活性(PAI)、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)，ELISA法測定血小板α顆粒膜蛋白(GMP-140)，凝血因子VⅡ活性(FⅦc)檢測采用一期法進(jìn)行檢測。結(jié)果：1.CHD血瘀證家系組AgⅡ含量高于CHD非血瘀證家系組、健康對照組(p＜0.01或p＜0.05)。CHD血瘀證家系組ET含量、

13、NO含量、NO/ET與健康對照組比較有顯著性差異(p＜0.01)，與CHD非血瘀證家系組相比差異無顯著性意義(p＞0.05)。2.CHD血瘀證家系患者血漿ATⅢ濃度明顯低于CHD非血瘀證家系組和健康對照組，GMP-140含量、PAI活性明顯高于CHD非血瘀證家系組和健康對照組(p＜0.05～0.01)，tPA的活性明顯低于健康對照組(P＜0.01)，與CHD非血瘀證家系組無差異。3.ACE基因I/D多態(tài)性對ET/N0的影響：CHD血瘀證

14、家系組、CHD非血瘀家系組、健康對照組ACE基因3個基因型ET/NO值呈現(xiàn)Ⅱ→ID→DD的遞增趨勢。DD型比Ⅱ型ET/NO值顯著增高(p＜0.05或＜0.01)。4.FVⅡ基因多態(tài)性與血漿FVⅡ活性(FVⅡc)的關(guān)系：其中M1M1基因型的FVⅡc含量呈CHD血瘀證家系組＞CHD非血瘀證家系組＞健康對照組呈遞減趨勢；而M1M2基因型相反。5.PAI-1基因多態(tài)性與PAI-1的活性關(guān)系：PAI-1的活性與CA拷貝數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)，拷貝數(shù)越少，

15、PAI-1活性越高；其中以血瘀證PAI-1活性更高，冠心病血瘀證家系組CA重復(fù)拷貝數(shù)N＜2O的例數(shù)明顯高于非血瘀證組。 結(jié)論： 1.冠心病血瘀證家系存在血管舒縮功能紊亂，表現(xiàn)為血管持續(xù)痙攣狀態(tài)。 2.冠心病血瘀證家系存在凝血、抗凝血及纖溶系統(tǒng)等功能紊亂，表現(xiàn)為血栓前高凝狀態(tài)。 3.血瘀證家系組ACE基因?qū)T／NO值表明DD型比Ⅱ型明顯升高，可能是ACE引起冠狀動脈痙攣的又一重要作用機制。 4.血瘀證家