甜瓜生長發(fā)育和脅迫條件下實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前較為常用的一種驗(yàn)證基因表達(dá)穩(wěn)定性的方法，為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果，在進(jìn)行qRT-PCR時(shí)常常需要合適的內(nèi)參基因來驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化目的基因，此類基因在所有的樣品和處理中均能夠穩(wěn)定表達(dá)。目前關(guān)于甜瓜內(nèi)參基因的研究很少，為了選取適用于甜瓜基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因，我們分別對10個候選內(nèi)參基因在甜瓜不同發(fā)育期不同組織26個樣本中的表達(dá)量和11候選內(nèi)參基因在生物脅迫（霜霉病菌）和非生物脅迫（不同激素、熱激/冷害、霜霉病菌/

2、鹽）27個樣本中的表達(dá)量了分析。為了獲得最適合用于甜瓜基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper3種軟件對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)所有候選內(nèi)參基因的在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性均存在一定的變化。具體研究結(jié)果如下：
　　1、本試驗(yàn)所用的是異硫氰酸胍RNA提取法，我們在試驗(yàn)過程中對提取方法進(jìn)行了一定的改進(jìn)，如：縮短水浴時(shí)間等，進(jìn)而得到了完整性較好、無降解且純度高的RNA，完全滿

3、足后續(xù)試驗(yàn)的要求。
　　2、在甜瓜營養(yǎng)器官中，geNorm分析的結(jié)果顯示，總樣品、根、莖葉樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的基因分別是(actin、actin3)、（actin、actin3)、（actin1、actin5)；根據(jù)NormFinder的分析結(jié)果，actin3在營養(yǎng)器官總樣品、根、莖、葉樣品中均為表達(dá)最穩(wěn)定的基因；BestKeeper的分析結(jié)果顯示，在總樣品、根、莖葉樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的基因分別是actin3、actin3、actin

4、2。綜合考慮根樣品中最適合的內(nèi)參基因?yàn)閍ctin3，而在莖葉樣品中最合適的內(nèi)參基因是actin1，營養(yǎng)器官總樣品中最適合的內(nèi)參基因?yàn)閍ctin3。
　　3、在甜瓜生殖器官中，3個軟件的分析結(jié)果略有不同。geNorm分析的結(jié)果顯示在總樣品、雌雄花、果實(shí)種子樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是(actin、actin3)、（actin1、UBI-ep）、（actin、actin4）；NormFinder分析結(jié)果表明在總樣品、雌雄花、果實(shí)種

5、子樣品中基因actin3、actin3、CYC的表達(dá)最為穩(wěn)定；根據(jù)BestKeeper的分析結(jié)果，actin3、actin、18s rRNA分別為生殖器官總樣品、雌雄花、果實(shí)種子樣品中最適合的內(nèi)參基因。
　　結(jié)合3種方法考慮，推薦actin3、actin、actin分別作為生殖器官總樣品、雌雄花、果實(shí)種子樣品研究的內(nèi)參基因。
　　4、在甜瓜生物和非生物脅迫處理中，geNorm分析的結(jié)果顯示總樣品、不同激素脅迫、高低溫脅迫、霜

6、霉病菌/鹽脅迫中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是(actin、actin3)、(actin、actin3)、（actin4、EFla）、（actin4、actin5）；NormFinder分析結(jié)果顯示在總樣品、不同激素脅迫、高低溫脅迫、霜霉病菌/鹽脅迫中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是TUA、actin5、actin4、TUA；BestKeeper的分析結(jié)果顯示總樣品、不同激素脅迫、高低溫脅迫、霜霉病菌/鹽脅迫中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是ac