檢測(cè)口蹄疫抗體間接ELISA方法的建立和應(yīng)用以及新型佐劑對(duì)口蹄疫疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、1 FMDV vp1基因的克隆及表達(dá) 參照GenBank中的O型FMDV(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的vpl基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增得到一969bp的DNA片段，測(cè)序后以該片段為模板，用特異性表達(dá)引物擴(kuò)增得到目的基因vpl(652bp)。然后克隆到pMD18-T載體中，從T-載體中切下目的片段，定向克隆到pGEX-4T-2中，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘

2、導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，目的基因獲得高效表達(dá)，免疫轉(zhuǎn) 印鑒定呈陽(yáng)性，vpl基因體外獲得成功表達(dá)。 2 FMDV 3abc基因的克隆及表達(dá) 將O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC首先克隆入pMD18-T Vector，然后亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX／3ABC。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感

3、受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE可檢測(cè)到分子量約為71kD的目的蛋白帶，經(jīng)薄層掃描分析，目的蛋白約占菌體總蛋白的15％。Western blotting分析證明表達(dá)產(chǎn)物能被FMDV陽(yáng)性血清所識(shí)別。 3 表達(dá)蛋白VPl和3ABC的間接ELISA的建立及應(yīng)用 FMDV的兩種表達(dá)產(chǎn)物(VPl，3ABC)經(jīng)GST.Bind Resin純化后，作為抗原建豆了間接ELISA(VPl-ELISA，3ABC-ELISA)，VP

4、l、3ABC抗原包被濃度分別為58.25 μ g／ml，7.84μg／ml，血清檢測(cè)稀釋度均為1:40 ，抗原與抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間為120min。 應(yīng)用VPl-ELISA和液相阻斷ELISA診斷試劑盒同時(shí)檢測(cè)400份臨床樣品，試劑盒的檢出率為88.25％，VPl-ELISA的檢出率為86.25％，二者的符合率達(dá)98％。 應(yīng)用3ABC-ELIsA和蘭州獸醫(yī)研究所的NSP-ELIsA診斷試劑盒同時(shí)檢測(cè)400份臨床樣品，試劑盒

5、的檢出率為3％，VPl-ELISA的檢出率為4％，二者的符合率達(dá)99％。 結(jié)果表明VPl-ELISA可以用于監(jiān)測(cè)牛血清抗體水平變化，3ABC-ELISA可用于區(qū)分滅活疫苗免疫和野毒感染。4 LTB的克隆與表達(dá) 通過(guò)PCR擴(kuò)增LTB蛋白全基因片段的，將其按正確的閱讀框架定向克隆到表達(dá)載體pET 32a中；用此重組質(zhì)粒pET 32a/LTB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)codon plus菌株，在濃度為lmM IPTG和30℃條件

6、下誘導(dǎo)表達(dá)；經(jīng)SDS-PAGE及免疫轉(zhuǎn)印鑒定結(jié)果顯示：重組蛋白具有免疫原性。5新型佐劑對(duì)FMDV抗原的免疫增強(qiáng)作用 重組表達(dá)的LTB蛋白經(jīng)鎳柱純化后透析復(fù)性，然后與STET-CTAB法提取的細(xì)菌CpGNDA分別單獨(dú)和共同與O型FMD滅活疫苗聯(lián)用，分6組共免疫60只豚鼠，分別用間接ELISA和終點(diǎn)法檢測(cè)不同免疫階段的126份豚鼠血清樣品的血清抗體校價(jià)和中和抗體水平。結(jié)果表明，單獨(dú)的CpG組比傳統(tǒng)的油佐劑組效果稍好，而當(dāng)LTB與CpG共同